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Dissertações |
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RODRIGO ALEX HENRIQUEZ ARANCIBIA
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A DINÂMICA DA PERSISTÊNCIA DE TRYPANOSOMA CRUZI: UMA ABORDAGEM ECOLÓGICA-EVOLUTIVA
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Orientador : LEANDRO MARTINS DE FREITAS
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MEMBROS DA BANCA :
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BRUNO LOPES BASTOS
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LEANDRO MARTINS DE FREITAS
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LUCAS MIRANDA MARQUES
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Data: 21/02/2022
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A doença de Chagas é uma doença tropical negligenciada endêmica do continente americano tendo como agente etiológico o protozoário Trypanosoma cruzi. Esta doença apresenta um grande impacto para saúde pública, afetando cerca de 6-7 milhões de pessoas ao redor do mundo. Atualmente há limitações em seu tratamento e prevenção, como a falta de vacina e de medicamentos amplamente eficazes. O parasita apresenta tipicamente um complexo ciclo de vida envolvendo o vetor inseto triatomíneo e o hospedeiro mamífero, além de outros meios de transmissão por alimentos contaminados por T. cruzi ou congênita. A doença de Chagas em seu percurso clínico apresenta duas fases: aguda caracterizada por forte resposta imunológica com redução da parasitemia, mas não havendo a eliminação da infecção, e a crônica predominantemente assintomática em um menor percentual manifestando síndromes cardíacas e/ou gastrointestinais anos após a infecção. Entretanto as causas que levam a manifestação ou não de sintomas da fase crônica não estão totalmente esclarecidas. Propomos investigar a dinâmica e mecanismos subjacentes infecção. O T. cruzi apresenta fatores de virulência que o auxiliam na evasão do sistema imune e na sua manutenção no hospedeiro. Considerando o longo processo de interação molecular como agente de pressão seletiva sugerimos que a eficiência de alguns desses mecanismos de virulência, com os protagonizados pelas proteínas de superfície parasitária, se deve a certa similaridade com proteínas humanas devido a uma convergência evolutiva molecular. Buscando indícios desta hipótese, nós realizamos análises de similaridade entre proteínas de superfície do T. cruzi e do sistema imunológico e transdução de sinal humano. Além disso os eventos ocorridos durante a fase aguda parecem repercutir de maneira decisiva no desenvolvimento posterior da doença, como na definição do estado de resistência e susceptibilidade do hospedeiro, apresentamos então um modelo matemático que propõe investigar os cenários na dinâmica parasita-hospedeiro que terminam os estados de susceptibilidade e resistência em uma infecção por T. cruzi. este simula características relevantes da dinâmica da fase aguda da doença de Chagas.
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Chagas disease is a neglected tropical disease endemic to the American continent with Trypanosoma cruzi as its etiologic agent. This disease has a major impact on public health, affecting about 6 -8 million people around the world. Currently, there are limitations in its treatment and prevention, such as the lack of vaccines and widely effective drugs. The parasite typically presents a complex life cycle involving the triatomine insect vector and the mammalian host, in addition to other means of transmission such as oral and congenital. Chagas disease in its clinical course has two phases: the acute phase characterized by a strong immune response, reduction of parasitemia, but without the elimination of the infection leading to chronification and the chronic phase, predominantly asymptomatic in a smaller percentage, manifesting cardiac and/or gastrointestinal syndromes. years after infection. However, the causes that lead to the manifestation or not of symptoms of the chronic phase are not fully understood. We propose to investigate the dynamics and mechanisms underlying chronification. The Trypanosoma cruzi has virulence factors that help it evade the immune system and maintain it in the host. Considering the long process of molecular interaction as a selective pressure agent, we suggest that the efficiency of some of these virulence mechanisms, with those carried out by proteins of parasitic surface, is due to a certain similarity with human proteins due to a molecular evolutionary convergence. we search for evidence of this hypothesis; we carry out analyzes of similarity between Trypanosoma cruzi surface proteins and the immune system and human signal transduction. Also, the events that occurred during the acute phase seem to have a decisive impact on the later development of the disease, as in the definition of the host's state of resistance and susceptibility. We then present a mathematical model that proposes to investigate the scenarios in the parasite-system dynamics that end the states of susceptibility and resistance in infection by Trypanosoma cruzi. It simulates relevant characteristics of the dynamics of the acute phase of Chagas disease.
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Emília Turlande Sêneca Ribeiro dos Santos
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CARACTERIZAÇÃO FENOTÍPICA E MOLECULAR DE Escherichia coli ISOLADAS A PARTIR DE PRODUTOS AVÍCOLAS CAIPIRAS COMERCIALIZADOS INFORMALMENTE EM REGIÃO DE CLIMA TROPICAL
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Orientador : MELISSA HANZEN PINNA VALENTIM
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MEMBROS DA BANCA :
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CARLOS PASQUALIN CAVALHEIRO
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MATEUS MATIUZZI DA COSTA
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MELISSA HANZEN PINNA VALENTIM
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Data: 20/06/2022
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As Doenças Veiculadas por Alimentos (DVAs) constituem eventos de saúde pública de notificação compulsória imediata e frequentemente estão associadas ao consumo de produtos de origem animal contaminados por bactérias. No Brasil, Escherichia coli o principal patógeno envolvido em surtos de DVAs. Nos últimos anos, os produtos avícolas caipiras apresentaram maior visibilidade no mercado. No entanto, pode ocorrer negligência quanto à vigilância sanitária para comercialização destes produtos, o que propicia risco sanitário devido à maior possibilidade de veiculação de microrganismos patogênicos, inclusive resistentes a antimicrobianos. Objetivou-se investigar a presença de Escherichia coli em produtos avícolas caipiras comercializados informalmente e avaliar a circulação de cepas de E. coli diarreiogênicas e resistentes a antimicrobianos. Assim, foram analisados 38 pools de ovos caipiras e 26 carcaças de frangos caipiras oriundos de pontos informais de comercialização na cidade de Salvador-Bahia. A partir destas amostras, 30 isolados foram identificados como Escherichia coli por MALDI-TOF, perfazendo taxa de 92,3% (24/26 carcaças) de contaminação das amostras de carne e 15,8% (6/38 pools) das amostras de ovos. Os isolados foram submetidos ao sistema VITEK®2 para determinar o padrão de suscetibilidade a classes de antimicrobianos clinicamente relevantes, como penicilinas, cefalosporinas e carbapenêmicos do grupo β-lactâmicos, aminoglicosídeos e quinolonas. Identificou-se índice total de 46,7% (14/30) de resistência a pelo menos um dos antimicrobianos testados, com 35,7% (5/14) caracterizados como multirresistentes por apresentarem resistência a três ou mais classes de antimicrobianos. A prevalência de resistência foi maior para Ciprofloxacina com 33,3% (10/30), Ceftriaxona com 26,7% (8/30) e Ampicilina/Sulbactam com 20% (6/30). Ademais, 8/30 (26,7%) apresentaram fenótipo para produção de beta-lactamase de espectro estendido (ESBL). Na caracterização molecular por PCR, 60% (18/30) dos isolados de E. coli foram caracterizados como pertencentes ao grupo DEC, com maior prevalência para o patotipo EAEC atípico, [38,9% (7/18)] e DAEC [22,0% (4/18)], além da caracterização de cepas híbridas. Dos 30 isolados, 19 (63,3%) apresentaram ao menos um gene de resistência a β-lactâmicos, com maior frequência observada para os genes blaCTX-M 1 e blaTEM, com 63% (12/19) e 47% (9/19), respectivamente, seguido por blaOXA-1 e blaSHV com 10,5% (2/19) cada. A detecção de E.coli diarreiogênicas, multirresistentes e/ou produtoras de ESBL em produtos avícolas caipiras comercializados em país com fins turísticos ratifica o potencial de veiculação destes microrganismos através de animais de produção, com consequente contribuição para ocorrência de DVAs e emergência global de resistência a antimicrobianos.
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Foodborne Diseases are public health events with immediate compulsory notification and often associated with the consumption of animal products contaminated by bacteria. Escherichia coli is the main pathogen involved in foodborne outbreaks in Brazil. In recent years, free-range poultry products have shown greater visibility in the market. However, may there is negligence in terms of health surveillance for the marketing of these products, which provides health risk due to the greater possibility of spreading pathogenic microorganisms, including those resistant to antimicrobials. The aim was to investigate the presence of Escherichia coli in free-range poultry products sold informally and evaluate antimicrobials resistant E. coli circulation. Therefore, 38 free-range egg pools and 26 free-range chicken carcasses from informal marketing in Salvador-Bahia were analyzed. 30 isolates were obtained and identified as Escherichia coli by MALDI-TOF, with contamination rate of 92.3% (24/26 carcasses) of meat samples and 15.8% (6/38 pools) of egg samples. The isolates were submitted to the VITEK®2 System to determine the susceptibility pattern to clinically relevant classes of antimicrobials, such as penicillins, cephalosporins and carbapenems of the β-lactam group, aminoglycosides and quinolones. A total index of 46.7% (14/30) of resistance to at least one of tested antimicrobials was identified, with 35.7% (5/14) characterized as multidrug-resistants because they presented resistance to three or more classes of antimicrobials. The prevalence of resistance was higher for Ciprofloxacin with 33.3% (10/30), Ceftriaxone with 26.7% (8/30) and Ampicillin /Sulbactam with 20% (6/30). 8/30 (26.7%) presented phenotype for Extended-Spectrum Beta-Lactamase (ESBL) producing. In molecular characterization by PCR, 60% (18/30) of E. coli isolates were characterized as DEC group, with a higher prevalence for the atypical EAEC [38.9% (7/18)] and DAEC [22, 0% (4/18)], in addition to characterization of hybrid strains. Of the 30 isolates, 19 (63.3%) presented at least one β-lactam resistance gene, with a higher frequency observed for the blaCTX-M 1 and blaTEM genes, with 63% (12/19) and 47% (9/19), respectively, followed by blaOXA-1 and blaSHV with 10.5% (2/19) each. The detection of diarrheagenic, multidrug-resistant and/or ESBL-producing E.coli in free-range poultry products sold in a country for tourist purposes confirms the potential for these microorganisms to be transmitted through production animals, hence contributing to the occurrence of Foodborne Diseases and the global emergence of antimicrobial resistance.
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Sabrina Ferreira de Santana
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Uso da metatranscriptômica para detecção de patógenos
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Orientador : ERIC ROBERTO GUIMARAES ROCHA AGUIAR
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MEMBROS DA BANCA :
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PAULA LUIZE CAMARGOS FONSECA
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ERIC ROBERTO GUIMARAES ROCHA AGUIAR
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LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
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Data: 30/06/2022
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Existem diversos patógenos que se configuram ameaças constantes tanto para saúde pública humana como para agricultura, levando a grandes impactos sociais e econômicos. Atualmente, os vírus encontram-se em maior destaque pela rápida taxa mutacional e espalhamento, serem influenciados pelo ambiente e estarem associados a grande amplitude de hospedeiros, infectando desde mamíferos superiores até organismos unicelulares. O exemplo mais recente relacionado à saúde pública humana é o SARS-CoV-2, que possui rápida disseminação associada à ausência de imunidade populacional, levando ao cenário pandêmico. Existem também vírus associados a outros microrganismos, como fungos. Muitos fungos causam grande impacto na agricultura, como Ceratocystis que que infecta diversas plantas de importância agrícola como a manga e o eucalipto, impactando a produtividade podendo levá-las à morte. Com isso, o monitoramento se torna estratégia importante para avaliação epidemiológica de agentes infecciosos e dos microrganismos associados que podem impactar no resultado das infecções, causando tanto hipovirulência quanto hipervirulência. Novas ferramentas computacionais podem ajudar no desenvolvimento de ações mais eficientes no monitoramento e desenvolvimento de estratégias de manejo das doenças. Métodos robustos auxiliam na avaliação de dados complexos permitindo rápido monitoramento de ameaças. Tendo isso em vista, o objetivo deste projeto foi avaliar e aplicar a metatranscriptômica como ferramenta de identificação de patógenos em amostras derivadas de diferentes organismos. Para tal, foram analisados dados de pacientes positivos para COVID-19 do Estado da Bahia, e a biblioteca pública do fungo Ceratocystis cacaofunesta. Em ambos os casos foi realizada parte da análise de bioinformática através da plataforma on-line Galaxy e a classificação taxonômica foi realizada com as ferramentas Kaiju e Kraken. Para a Ceratocystis também foi utilizado o programa BLAST visando a busca de similaridade, HMMER e InterProScan com o objetivo de encontrar os domínios conservados, AliView para edição das sequências, MAFFT para realizar o alinhamento global, CIPRES para busca do melhor modelo e construção da árvore filogenética e, por fim, o iTol para visualização da árvore filogenética. Após as análises, para as amostras derivadas de humanos sabidamente infectados com SARS-CoV-2, existiam, principalmente, bactérias presentes no trato respiratório desses indivíduos. Com isso, os dados foram comparados com a literatura visando avaliar quais microrganismos pertencem ao trato respiratório e identificar quais das espécies encontradas têm potencial ou já foram descritas agindo como patógenos oportunistas co-circulando com o SARS-CoV-2. Já para o fungo Ceratocystis, foram encontradas diversas sequências virais, incluindo pertencentes às famílias Hypoviridae, Mymonaviridae, Narnaviridae e Partitiviridae. Também foram observados domínios conservados associados às sequências, além de ter confirmada a designação a nível de família dos novos vírus através da análise filogenética. Em suma, análises metagenômicas associadas à bioinformática têm se mostrado essenciais para melhor compreensão e monitoramento de patógenos e nosso trabalho reforçou o potencial do Sequenciamento de Nova Geração de RNAs nesse processo.
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There are several pathogens that constitute constant threats to both human public health and agriculture, leading to great social and economic impacts. Currently, viruses are more prominent due to their rapid mutational rate and spread, being influenced by the environment and being associated with a wide range of hosts, infecting from higher mammals to unicellular organisms. The most recent example related to human public health is SARS-CoV-2, which has a rapid spread associated with the absence of population immunity, leading to the pandemic scenario. There are also viruses associated with other microorganisms, such as fungi. Many fungi have a great impact on agriculture, such as Ceratocystis which infects several plants of agricultural importance such as mango and eucalyptus, impacting productivity and leading to death. Thus, monitoring becomes an important strategy for epidemiological assessment of infectious agents and associated microorganisms that can impact the outcome of infections, causing both hypovirulence and hypervirulence. New computational tools can help in the development of more efficient actions in the monitoring and development of disease management strategies. Robust methods assist in the evaluation of complex data allowing rapid monitoring of threats. With this in mind, the objective of this project was to evaluate and apply metatranscriptomics as a tool to identify pathogens in samples derived from different organisms. To this end, data from patients positive for COVID-19 in the State of Bahia and the public library of the fungus Ceratocystis cacaofunesta were analyzed. In both cases, part of the bioinformatics analysis was carried out through the Galaxy online platform and the taxonomic classification was carried out with the Kaiju and Kraken tools. For Ceratocystis, the BLAST program was also used to search for similarity, HMMER and InterProScan to find the conserved domains, AliView to edit the sequences, MAFFT to perform the global alignment, CIPRES to search for the best model and build the tree. phylogenetics and, finally, iTol to visualize the phylogenetic tree. After analysis, for samples derived from humans known to be infected with SARS-CoV-2, there were mainly bacteria present in the respiratory tract of these individuals. Thus, the data were compared with the literature in order to assess which microorganisms belong to the respiratory tract and identify which of the species found have potential or have already been described acting as opportunistic pathogens co-circulating with SARS-CoV-2. As for the fungus Ceratocystis, several viral sequences were found, including those belonging to the families Hypoviridae, Mymonaviridae, Narnaviridae and Partitiviridae. Conserved domains associated with the sequences were also observed, in addition to having confirmed the family-level designation of the new viruses through phylogenetic analysis. In short, metagenomic analyzes associated with bioinformatics have been shown to be essential for a better understanding and monitoring of pathogens and our work reinforced the potential of Next Generation RNAs Sequencing in this process.
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TATIALE DE OLIVEIRA RODRIGUES
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PRODUÇÃO DA PROTEÍNA RECOMBINANTE Pr55gag PARA USO NO DIAGNÓSTICO DA ANEMIA INFECCIOSA EQUINA
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Orientador : SILVIA INES SARDI
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MEMBROS DA BANCA :
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CAMILA FONSECA LOPES BRANDAO
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DELLANE MARTINS TIGRE
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SILVIA INES SARDI
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Data: 06/07/2022
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A Anemia Infecciosa Equina é causada por um Lentivirus e atinge equídeos no mundo todo, causando desde um quadro assintomático até uma doença fatal. Não existem vacinas nem tratamentos eficazes e as medidas de controle recomendadas pelas autoridades incluem a testagem de animais em trânsito e o isolamento ou a eutanásia dos positivos. Por se tratar de uma doença grave cujo diagnóstico define a vida dos animais, é importante dispor de testes diagnósticos mais acurados possível. O método diagnóstico padrão ouro é a Imunodifusão em Gel de Agarose que utiliza como antígeno a proteína de cápside viral, p26, proveniente de cultivo de vírions em células eucarióticas. Com os avanços tecnológicos na área é possível produzir proteínas virais através da tecnologia do DNA recombinante e utilizá-las como antígenos em testes diagnósticos. A proteína precursora Pr55gag compartilha antigenicidade com as proteínas estruturais de EIAV nas quais ela é clivada, portanto deve promover maior sensibilidade ao teste diagnóstico. Desta forma, objetivou-se produzir a proteína Pr55gag em sistema procariótico e avaliar seu potencial como antígeno no diagnóstico sorológico da AIE. Assim, o gene gag foi inserido no plasmídeo pET_TEV e este foi clonado em Escherichia coli C41 (DE3). Com este sistema bacteriano, foi possível expressar a proteína, sob indução com IPTG. A proteína foi purificada em coluna de afinidade à histidina, passou por diálise em PBS e foi concentrada pelo sistema VivaSpin® de concentração. A proteína recombinante obtida desta metodologia foi utilizada como antígeno em um Western blot, no qual foram testados 56 soros equinos cedidos pela Agência Estadual de Defesa Agropecuária da Bahia (ADAB) e previamente submetidos à IDGA. A comparação dos resultados de ambos os testes indica uma concordância quase perfeita entre os dois (Kappa=0,82). Além de ser de mais rápida execução, o Western blot com a proteína recombinante foi mais sensível, pois identificou mais animais positivos (23/56) do que a IDGA (19/56). Os resultados demonstram que a proteína recombinante Pr55gag, obtida de forma rápida, eficiente e com rendimento satisfatório, pode ser utilizada como antígeno nos testes diagnósticos para Anemia Infecciosa Equina, proporcionando maior sensibilidade ao detectar maior número de animais positivos.
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Equine Infectious Anemia is caused by a Lentivirus that affects equids all over the world and clinical manifestation ranges from an asymptomatic to a lethal disease. There is no reliable vaccine, so the disease control and management, as recommended by the sanitary authorities includes testing animals before relocation and euthanasia for the positive ones. Due to the gravity of the disease and the fact that the diagnosis settles the destiny of animals’ lives, it is crucial that diagnostic be the most accurate as possible. The golden standard diagnosis method is Agarose Gel Immunodiffusion (AGID) with virion core protein p26, obtained from eukaryotic cell culture, as antigen. As the technology has improved, it is possible to produce viral proteins using the recombinant DNA and use them as antigen to develop more effective tests. The precursor protein Pr55gag shares antigenicity with the structural proteins of EIAV into which it is cleaved, therefore it should promote greater sensitivity to the diagnostic test. This study aimed to produce the Pr55gag protein in a prokaryotic system to avaluate its potential as an antigen in serological diagnosis. Thus, EIAV gag gene was inserted in plasmid pET_TEV that was cloned into Escherichia coli C41 (DE3) linage. This expression system was used to express the protein inducted with IPTG. The protein was purified on a histidine affinity column, underwent dialysis in PBS to remove excess salts and imidazole and was concentrated with a VivaSpin® system of centrifugation. The recombinant protein obtained from this methodology was used as an antigen in a Western blotting, in which 56 equine sera provided by the State Agricultural Defense Agency of Bahia (ADAB) and previously submitted to AGID were tested. Kappa coefficient of 0.82 indicates an almost perfect agreement between the results of both tests. In addition to being faster to perform, it is suggested that Western blotting with the recombinant protein is more sensitive, as it was able to identify more positive animals (23/56) than IDGA (19/56). Preliminary results suggest that the recombinant protein Pr55gag, obtained quickly, efficiently, with low cost and satisfactory yield, can be used as an antigen in diagnostic tests for Equine Infectious Anemia providing a more sensitive test by detecting a higher number of positive animals.
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Carolina Ferreira Amorim
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Atividade de porfirinas fotoativadas sobre Candida spp.
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Orientador : VASCO ARISTON DE CARVALHO AZEVEDO
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MEMBROS DA BANCA :
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Aristóteles Góes-Neto
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SAMIRA ABDALLAH HANNA
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VASCO ARISTON DE CARVALHO AZEVEDO
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Data: 28/07/2022
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Candida spp. é o principal gênero fúngico associado a infecções em seres humanos, e seu tratamento vem se tornando um desafio devido à produção de biofilme e ao seu perfil de resistência/multirresistência a antifúngicos convencionais. A terapia fotodinâmica antimicrobiana se destaca como tratamento caracterizado pelo amplo espectro de ação antimicrobicida, sendo capaz de induzir estresse oxidativo em microrganismos, e as porfirinas são fotossensibilizadores com alta seletividade aos patógenos. Dessa forma, este trabalho teve como objetivo analisar a fotoinativação de diferentes espécies de Candida por duas porfirinas catiônicas (4-H2TMeP+ e 3-H2TMeP+) e uma aniônica (4-H2TPSP-). Foram realizados ensaios de microdiluição para determinação de CIM100, posterior determinação de CFM100, verificação da ação sobre biofilme, efeito potencializante do iodeto de potássio, determinação de espécie oxidativa envolvida através do uso de sequestradores, e análises em microscopia de força atômica (AFM). As porfirinas catiônicas foram significativamente eficientes na inativação de Candida albicans e espécies não-albicans com 100% de inibição de crescimento e atividade fungicida (CFM100/CIM100 < 4). As porfirinas catiônicas demonstraram interferência na formação de biofilme de Candida spp. O mecanismo fotooxidativo ativado por 3-H2TMeP+ em Candida spp. envolveu principalmente a produção de oxigênio singleto. O efeito fotooxidante nessas leveduras foi potencializado com a adição de iodeto de potássio. Na AFM, 3-H2TMeP+ foi capaz de reduzir a adesão de C. parapsilosis em superfície. Assim, conclui-se que o uso de fotossensibilizadores porfirínicos tem significativo potencial de originar um tratamento alternativo e/ou complementar para infecções causadas por diferentes espécies de Candida.
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Candida spp. is the main fungal genus associated to infections in humans, and its treatment has become a challenge due to the production of biofilm and its resistance/multi-resistance profile to conventional antifungals. Antimicrobial photodynamic therapy stands out as a treatment characterized by a broad spectrum of antimicrobial action, being able to induce oxidative stress in different microorganisms, and porphyrins are photosensitizers with high selectivity to pathogens. Thus, this work aimed to analyze the photoinactivation of different species of Candida by two cationic (4-H2TMeP+ and 3-H2TMeP+) and one anionic (4-H2TPSP-) porphyrins. Microdilution assays were performed to determine the MIC100, with subsequent determination of MFC100, verification of the action on biofilm, determination of the oxidative species involved through the use of scavengers, potentiation with iodide, and analysis using the atomic force microscopy (AFM). Cationic porphyrins were significantly efficient in inactivating Candida albicans and non-albicans species with 100% growth inhibition and fungicidal activity (MFC100/MIC100 < 4). The cationic porphyrins were able to interfere in Candida spp biofilm formation. The photooxidative mechanism activated by 3-H2TMeP+ in Candida spp. involved mainly the production of singlet oxygen. The photooxidant effect in these yeasts was potentiated with the addition of potassium iodide. In the AFM, 3-H2TMeP+ was able to reduce C. parapsilosis adhesion to the surface. Thus, it is concluded that the use of porphyrin photosensitizers has significant potential in the development of an alternative and/or complementary treatment for infections caused by different Candida species.
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