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Dissertações |
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PRISCYLA DOS SANTOS RIBEIRO
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REVISITANDO O CRESCIMENTO DE LEPTOSPIRAS ATRAVÉS DE BIOFILMES: UMA DIMINUIÇÃO NO METABOLISMO DE CRESCIMENTO
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Orientador : PAULA CARVALHAL LAGE VON BUETTNER RISTOW
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MEMBROS DA BANCA :
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PAULA CARVALHAL LAGE VON BUETTNER RISTOW
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ANGELA SILVA BARBOSA
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LUCY SELDIN
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Data: 28/11/2018
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Os biofilmes são o principal modo de vida no qual os microrganismos são encontrados na natureza. Nesse fenótipo, bactérias apresentam características metabólicas únicas, incluindo mudanças no crescimento, como tamanho celular e tempo de geração. Leptospiras, cujas espécies patogênicas causam a leptospirose, formam biofilmes in vitro e em ambientes naturais. Há pouca informação sobre o metabolismo de leptospiras em biofilmes. Neste trabalho nós analisamos aspectos fisiológicos e genômicos do crescimento de Leptospira em biofilmes. Nós cultivamos a espécie saprofítica Leptospira biflexa em biofilmes (BIOF) e planctônicas (PLANK) por sete dias a 29ºC. Realizamos curvas de crescimento através da contagem de bactérias a cada 12 h. Para o teste de viabilidade celular, nós coramos os biofilmes com o reagente Live / Dead, com observação em microscópio de fluorescência. Medimos o comprimento celular para avaliação morfológica durante as fases do crescimento. Analisamos a expressão diferencial da proteína estrutural OmpL36 através de Western blotting, comparando BIOF e PLANK. Finalmente, realizamos análise de homologias de genes de crescimento no genoma completo de L. biflexa e da expressão transcricional dos genes identificados (Bioproject PRJNA288909). Células de BIOF e PLANK apresentaram curvas clássicas de crescimento. O tempo de geração (TG) médio foi de 4,9 h (± 0,32) para BIOF, duas horas a menos do que para PLANK (6,9 h ± 0,24). Apesar do crescimento mais rápido demonstrado pelo TG menor, a concentração de células de BIOF foi aproximadamente dez vezes menor do que de PLANK. O teste de viabilidade mostrou que leptospiras no biofilme começam a morrer precocemente, com 24 h de incubação, em plena fase exponencial, o que pode explicar a menor concentração de células observada para este fenótipo. Além disso, observamos regulação negativa de 58% dos genes de crescimento no biofilme. Essa mudança foi mais proeminente no biofilme maduro (48 h), quando as células estão em transição para o estado estacionário. As análises de comprimento celular mostraram BIOF mais longas durante as fases estacionária e de declínio. A proteína OmpL36 foi mais expressa no biofilme maduro do que em células planctônicas. Coletivamente, nossos dados fornecem evidências de mudanças metabólicas e limitação do crescimento de Leptospira em biofilmes.
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Biofilms are the main way of life of microorganisms in nature. In this phenotype, bacteria have unique metabolic characteristics, including changes in growth such as cell size and generation time. Leptospires, whose pathogenic species cause leptospirosis, form biofilms in vitro and in natural environments. There is little information on the metabolism of leptospires in biofilms. In this work we analyzed physiological and genomic aspects of Leptospira growth in biofilms. We cultivated the saprophytic species Leptospira biflexa in biofilms (BIOF) and planktonic cells (PLANK) for seven days at 29ºC. We performed growth curves by counting bacteria every 12 h. For the cell viability test, we stained the biofilms with the Live / Dead reagent, with observation under a fluorescence microscope. We measured the cell length for morphological evaluation during the growth phases. We analyzed the differential expression of OmpL36 structural protein by Western blotting, comparing BIOF and PLANK. Finally, we performed analysis of growth gene homologies in the complete genome of L. biflexa and of the transcriptional expression of the identified genes (Bioproject PRJNA288909). BIOF and PLANK cells presented classic growth curves. The mean generation time (GT) was 4.9 h (± 0.32) for BIOF, two hours less than for PLANK (6.9 h ± 0.24). Despite the faster growth demonstrated by lower GT, the cell concentration of BIOF was approximately ten times lower than that of PLANK. The viability test showed that leptospires in the biofilm began to die earlier, with 24 h of incubation, during exponential phase, which may explain the lower concentration of cells observed for this phenotype. In addition, we observed negative regulation of 58% of growth genes in the biofilm. This change was more prominent in mature biofilm (48 h) when cells are in transition to stationary state. Cell length analyzes showed longer BIOF cells during stationary and decline phases. The OmpL36 protein was more expressed in the mature biofilm than in planktonic cells. Collectively, our data provide evidence of metabolic changes and growth limitation of Leptospira in biofilms.
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JOSY DE LIMA GODOI
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Identificação fenotípica e molecular de estirpes de E. coli provenientes de camarões (litopenaeus vannamei) obtidos do comércio informal em região de clima tropical
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Orientador : MELISSA HANZEN PINNA VALENTIM
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MEMBROS DA BANCA :
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MELISSA HANZEN PINNA VALENTIM
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JOICE NEVES REIS PEDREIRA
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JOSE ROBERTO PINHO DE ANDRADE LIMA
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Data: 29/11/2018
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Grande parte da comercialização de camarão em países tropicais é in natura e realizada através do comércio informal, com precária condição higiênico-sanitária, favorecendo a contaminação do alimento, principalmente por E. coli e consequente risco de infecção entérica para a população, através da exposição a cepas virulentas produtoras de ESBL e com relevância para a saúde pública. Objetivou-se a investigação de genes de virulência e de resistência em isolados de E. coli, obtidos de camarões (Litopenaeus vannamei), comercializados informalmente, através da identificação fenotípica e molecular. Para tanto, foram coletadas 22 amostras de camarões (500g, cada). Após maceração e diluição seriada, foi determinado o índice colimétrico para coliformes totais e termotolerantes e em seguida, o cultivo para isolamento e identificação fenotípica pelo sistema automatizado (VITEK® 2), bem como o teste para a resistência microbiana. Quanto à pesquisa dos genes de virulência e resistência realizou-se a reação em cadeia da polimerase para a caracterização molecular. Foram obtidos 24 isolados de E. coli, sendo 17 cepas comensais (17/24 - 70,8%) e sete cepas patogênicas (7/24 – 29,2%), incluindo quatro isolados EIEC (4/7 – 57,1%), dois isolados STEC (2/7 – 28,6%); um EHEC do sorotipo O157: H7 (1/7 – 14,3%) e uma híbrida STEC/ETEC (1/7 – 14,3%). O gene codificador de ESBL CTX-M foi identificado em 25% dos isolados (uma EHEC e cinco comensais). A identificação de patotipos de E. coli com perfil de resistência em camarões demonstra a circulação de genes e a relevância para a saúde pública uma vez que contribui para ocorrência de infecções resistentes à abordagem terapêutica, principalmente em países com fins turísticos, os quais recepcionam pessoas de diversas nacionalidades, o que ratifica a importância da segurança alimentar para a saúde pública.
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Many of the commercialization of shrimp in tropical countries is in natura and carried out through informal trade, with a precarious hygienic-sanitary condition, favoring the contamination of the food, mainly by E. coli and consequent risk of enteric infection for the population, through exposure to virulent ESBL-producing strains with relevance to public health. The objective of this study was to investigate virulence and resistance genes in E. coli isolates obtained from shrimp (Litopenaeus vannamei), marketed informally, through phenotypic and molecular identification. For this, 22 shrimp samples (500g, each) were collected. After maceration and serial dilution, the colimetric index was determined for total and thermotolerant coliforms and then the culture for isolation and phenotypic identification by the automated system (VITEK® 2), as well as the test for microbial resistance. As for the virulence and resistance genes, the polymerase chain reaction was carried out for molecular characterization. There were obtained 24 E. coli isolates, including 17 commensal strains (17/24 – 70,8%) and seven pathogenic strains (7/24 – 29,2%), including four EIEC isolates (4/7 – 57,1%), two STEC isolates (2/7 – 28,6%); an O157: H7 serotype EHEC (1/7 – 14,3%) and an STEC / ETEC hybrid (1/7 – 14,3%). The gene encoding ESBL CTX-M was identified in 25% of the isolates (one EHEC and five commensals). The identification of E. coli pathophyses with resistance profile in shrimps demonstrates gene circulation and relevance for public health since it contributes to the occurrence of infections resistant to the therapeutic approach, mainly in countries with tourist purposes, which receive people of different nationalities, which ratifies the importance of food safety for public health.
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AMANDA OLIVEIRA DOS SANTOS MELO NASCIMENTO
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DO FENÓTIPO AO GENÓTIPO: RECONSTRUÇÃO DO METABOLISMO ASSOCIADO À CONVERSÃO DE LIGNINA EM BACTÉRIAS LIGNOLÍTICAS DO GÊNERO KLEBSIELLA ISOLADAS DO BIOMA CAATINGA
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Orientador : THIAGO BRUCE RODRIGUES
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MEMBROS DA BANCA :
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THIAGO BRUCE RODRIGUES
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PEDRO MILET MEIRELLES
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AMARO EMILIANO TRINDADE SILVA
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Data: 29/11/2018
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A lignina é uma macromolécula amorfa tridimensional formada pela ligação, predominante β-aril-éter entre os álcoois cumarílico, sinapílico e coniferírilo. Justificada pela recalcitrância da lignina, a busca por bactérias naturalmente biodegradadoras de lignina tem sido alvo de estudo porque estas são de fácil cultivo e manipulação, mas ainda não se tem uma compreensão completa de como as bactérias possuem a habilidade de biodegradar a lignina. Objetivando identificar e caracterizar o sistema de degradação de lignina de procariotos ambientais, utilizou-se abordagens dependentes e independentes de cultivo. Para isso, no capítulo 1, as abordagens dependentes de cultivo permitiram a identificação taxonômica e caracterização funcional de linhagens de bactérias FP10-5.22 (Klebsiella variicola), P3TM1 (Klebsiella variicola) e FP10-5.23 (Klebsiella oxytoca), que apresentaram capacidade de crescimento em lignina como única fonte de carbono (fase estacionária em 24 horas) e até 98% de degradação do corante azul de metileno em 48 horas. Já no capítulo 2, são apresentados os dados referentes ao sequenciamento do genoma completo da linhagem lignolítica P1CD1 (K. variicola). O sequenciamento do genoma completo permitiu a identificação do repertório genético envolvido na degradação de lignina, bem como estabelecer as possíveis rotas metabólicas utilizadas pela linhagem P1CD1 para degradar lignina. Foram identificados 251 genes relacionados às atividades de transferase, desidrogenase, liase, regulador trascricional, monooxigenase, dioxigenase, redutase, hidrolase, peroxidase, isomerase, oxidase, transport, ligase, hidroxilase, superóxido e proteínas redox. O repertório genético identificado sugere que a lignina é degradada em duas etapas, a primeira refere-se à despolimerização da molécula primária da lignina (desacoplamento das ligações interunidades dos álcoois precursores) pela atividade das enzimas modificadores de lignina (LMEs) e as enzimas auxiliares de degradação de lignina (LDAs) gerando metabólitos periféricos, e a segunda etapa está relacionada com a decomposição de fragmentos derivados da lignina através da atividade das enzimas presentes nos subsistemas pertencentes ao metabolismo de compostos aromáticos, transformando os metabólitos periféricos em metabólitos intermediários da lignina. Os resultados dos capítulos 1 e 2 sugerem que procariotos de amostras de água e solo da Caatinga são alternativa viável para otimização da etapa de pré-tratamento da biomassa lignocelulósica, visto que apresentaram alto potencial lignolítico após as análises genômica e fenotípicas.
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Lignin is a three-dimensional amorphous macromolecule formed by binding, predominating β-aryl ether between coumaril, synapyl and coniferyl alcohols. Justified by the recalcitrance of lignin, the search for naturally biodegrading bacteria lignin has been the subject of studies because they are easy to grow and manipulate, but it does not have a complete understanding of how bacteria have the ability to degrade lignin. Aiming to identify and characterize the lignin degradation system of environmental prokaryotes, we used dependent and independent approaches to culture. In order to achieve this, in chapter 1, culture-dependent approaches allowed taxonomic identification and functional characterization of lineages of bacteria FP10-5.22 (Klebsiella variicola), P3TM1 (Klebsiella variicola) and FP10-5.23 (Klebsiella oxytoca), which presented growth capacity in lignin as the sole carbon source (stationary phase in 24 hours) and up to 98% degradation of the methylene blue dye in 48 hours. In chapter 2, the data referring to the sequencing of the complete genome of the ligninolytic line P1CD1 (K. variicola) are presented. The sequencing of the complete genome allowed the identification of the genetic repertoire involved in the degradation of lignin, as well as to establish the possible metabolic routes used by the lineage P1CD1 to degrade lignin. 251 genes related to transferase, dehydrogenase, lyase, transcriptional/regulatory, monooxygenase, dioxygenase, reductase, hydrolase, peroxidase, isomerase, oxidase, transport, ligase, hydroxylase, superoxide and redox proteins have been identified. The identified genetic repertoire suggests that lignin is degraded in two steps; the first step relates to the depolymerization of the primary lignin molecule (decoupling of the precursor alcohols interunit bonds) by the activity of the lignin-modifying enzymes (LMEs) and the auxiliary of lignin degradation enzymes of (LDAs) generating peripheral metabolites. The second stage is related to the decomposition of lignin-derived fragments through the activity of the enzymes present in the subsystems belonging to the metabolism of aromatic compounds, transforming the peripheral metabolites into intermediary lignin metabolites. The results of chapters 1 and 2 suggest that prokaryotes of Caatinga water and soil samples are a viable alternative for the optimization of the pre-treatment stage of lignocellulosic biomass, since they presented high ligninolytic potential after genomic and phenotypic analysis.
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LARISSA MORAES DOS SANTOS FONSECA
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Pesquisa de arboviroses emergentes: Vírus Mayaro, Oropouche e Rocio
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Orientador : GUBIO SOARES CAMPOS
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MEMBROS DA BANCA :
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GUBIO SOARES CAMPOS
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LUIS GUSTAVO CARVALHO PACHECO
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ELISANGELA DE JESUS CAMPOS
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Data: 30/11/2018
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Arbovírus (Arthropod-borne virus) são vírus transmitidos através da picada de artrópodes hematófagos e, portanto, responsáveis por causar doenças conhecidas por arboviroses. Com sintomatologia clínica muito semelhante e inespecífica, como febre, dores de cabeça, mialgia e artralgia, as arboviroses representam um grave problema de saúde pública mundial com impactos sociais e econômicos relevantes. Entre os arbovírus brasileiros, os vírus Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV), Febre Amarela (YFV), Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV), Rocio (ROCV) e Zika (ZIKV) são responsáveis pela maioria dos casos de arboviroses humanas no Brasil. No entanto, com exceção dos vírus CHIKV, DENV, YFV e ZIKV, não se tem informações sobre a circulação desses vírus no estado da Bahia. A emergência de arbovírus como CHIKV e ZIKV em centros urbanos do Brasil, ressalta a preocupação com o surgimento de outros arbovírus não encontrados anteriormente em outras regiões do país para além da Região Amazônica. Dito isso, o presente estudo teve como objetivo pesquisar a presença dos arbovírus MAYV, OROV e ROCV em amostras de soro, urina e saliva de pacientes residentes no Estado da Bahia com suspeita clínica de dengue. Esses pacientes manifestaram sintoma febril além de outros sintomas como: artralgia, cefaleia, mialgia, vômito e diarréia. Foram analisadas 554 amostras provenientes de unidade hospitalar privada de Salvador cujos testes para DENV, CHIKV e ZIKV apresentaram-se negativos. RT-PCR e nested-PCR foram realizados para detecção dos vírus MAY, ORO e ROC. Nenhuma amostra foi positiva para MAYV e ROCV e 18 amostras foram positivas para OROV dentre elas 6 de soro, 7 de saliva e 5 de urina. Esta foi a primeira vez que o OROV foi identificado no Brasil fora da região amazônica, no Estado da Bahia e em amostras de saliva e urina. Foi realizado sequenciamento do fragmento do gene codificante para as proteínas N e NSs do OROV de 7 amostras positivas e a análise filogenética mostrou que o vírus presente na Bahia agrupa-se ao genótipo I, o genótipo mais encontrado na Região Amazônica brasileira. A detecção do OROV na Bahia mostra a necessidade de um sistema de vigilância eficiente para controlar a disseminação deste vírus na população. Além disso, este trabalho sugere a utilização de amostras de saliva e urina como alternativa para a detecção de OROV quando amostras de soro são inviáveis.
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Arbovirus (Arthropod-borne viruses) are viruses transmitted through the bite of hematophagous arthropods and, therefore, responsible for causing diseases known as arboviruses. With very similar and unspecific clinical symptoms, such as fever, headache, myalgia, arthralgia and muscle pain, arboviruses represent a serious global public health problem with relevant social and economic impacts. Among the Brazilian arboviruses, Chikungunya (CHIKV), Dengue (DENV), Yellow Fever (YFV), Mayaro (MAYV), Oropouche (OROV), Rocio (ROCV) and Zika (ZIKV) viruses are responsible for most cases of human arboviruses in Brazil. However, except for CHIKV, DENV, YFV, and ZIKV, there is no information about the circulation of these viruses in Bahia State. The emergence of arboviruses such as CHIKV and Zika ZIKV in urban centers of Brazil highlights the concern with the emergence of other arboviruses not previously found in other regions beyond the Amazon Region. The aim of this study was to investigate the presence of MAY, ORO and ROC viruses in serum, urine and saliva samples of patients living in the State of Bahia with clinical suspicion of dengue. These patients manifested a febrile symptom in addition to other symptoms such as arthralgia, headache, myalgia, vomiting and diarrhoea. A total of 554 samples from patients from a private hospital in Salvador, Brazil, were tested for DENV, CHIKV and ZIKV. RT-PCR and nested-PCR were performed for the detection of MAY, ORO and ROC viruses. No samples were positive for MAYV and ROCV and 18 samples were positive for OROV among them 6 of serum, 7 of saliva and 5 of urine. This was the first time OROV was identified in Brazil outside the Amazon region, in Bahia State, and in samples of saliva and urine. Sequencing of the gene fragment coding for the N and NSs proteins of the 7 positive samples was performed and phylogenetic analysis showed that the virus present in Bahia State was grouped in genotype I, which is being the most distributed in the Brazilian Amazon region. The detection of OROV in Bahia shows the need for an efficient surveillance system to control the spread of this virus in the population. In addition, this work suggests the use of saliva and urine samples as an alternative for the detection of OROV when serum samples are not available.
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