Dissertações/Teses

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2021
Dissertações
1
  • STEVE BIKO MENEZES HORA ALVES RIBEIRO
  • CARACTERIZAÇÃO IMUNOGÊNICA DO GENE DO GRUPO ANTÍGENO (gag) DAS CEPAS DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA DO TIPO 1 (HIV-1) CIRCULANTES NO BRASIL.

  • Orientador : JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • ERIC ROBERTO GUIMARAES ROCHA AGUIAR
  • JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • Data: 26/02/2021

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  • RIBEIRO. S B M H A. Caracterização imunogênica do gene do grupo antígeno (gag) das cepas do vírus da imunodeficiência humana do tipo 1 (HIV-1) circulantes no Brasil, 2020. 105. Exame de Qualificação – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2020. A grande variabilidade genética do HIV representa um grande obstáculo tanto para o controle da infecção pelo sistema imune do hospedeiro como para o desenvolvimento de drogas e vacinas eficientes. Células CTLs que reconhecem epítopos codificados pelo gene do grupo antígeno (gag) do HIV têm sido associadas com o controle inicial da infecção e utilizadas em abordagens atuais de desenvolvimento de uma vacina para o HIV. Com isso, o objetivo deste estudo foi investigar a variabilidade dos epítopos ligantes de HLA de classe I no gene gag de cepas de HIV-1 circulantes no Brasil, disponíveis em banco de dados de acesso público. Para tanto, determinou-se a variabilidade e predominância alélica do HLA de classe I na população brasileira para que assim fosse feita a identificação de epítopos do gene gag de cepas de HIV-1 circulantes no Brasil. Para predominância alélica do HLA foi utilizada o Bando de Dados de Frequência Alélica (AFND), as regiões gag foram retiradas através do endereço eletrônico https://www.hiv.lanl.gov, com os genes previamente definidos (gag) e os alelos de HLA mais prevalentes na população brasileira. O Banco de Dados de Epítopos Imunes (IEDB), por meio da ferramenta de ligação foi usado para determinar quais são os melhores epítopos brasileiros de ligação ao HLA. Foi também realizado modelagem da estrutura proteica para o antígeno que obteve melhor valor de identidade, por meio do programa Swiss-Model. A partir dessa pesquisa gerou-se uma tabela com a descrição dos epítopos presentes nos subtipos mais circulantes no Brasil reconhecidos por cada alelo de HLA de classe I previamente determinado (HLA-A*2, A*24, A*03, A*01, A*68, B*35, B*44, B*15, B*51 e B*07), ao HXB2 e aos subtipos B, F e C do HIV-1 e a posição do epítopo em relação ao gene gag. Como resultado, foram encontradas 1320 epítopos totais, sendo 316 para HXB2, 336, 321 e 302 para os subtipos B, F1 e C respectivamente. A partir dessa análise preliminar foram encontrados 24 epítopos candidatos altamente conservados entre os subtipos B, F1 e C. Importante ressaltar que um dos epítopos identificados nesse estudo – EPRGSDIAGTTSTL - não foi descrito em banco de dados de patentes e na literatura acadêmica até essa data. Sendo assim, a variabilidade de epítopos ligantes de HLA de classe I no gene gag encontradas no presente estudo gerou dados que caracterizam e descrevem os epítopos circulantes no Brasil, contribuindo para o entendimento sobe a convergência desse epítopos no mundo e para o campo da pesquisa e desenvolvimento de vacinas. Logo, esse estudo irá contribuir de forma efetiva ao avaliar a variabilidade subtipo-específica de epítopos ligantes de alelos de HLA nos genomas dos diferentes subtipos e recombinantes de HIV-1 circulantes no Brasil.


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  • RIBEIRO. S B M H A. Immunogenic characterization of the antigen group (gag) gene of strains of the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) circulating in Brazil, 2020. 105. Exame de Qualificação – Instituto de Ciências da Saúde, Universidade Federal da Bahia, Salvador, 2020. The great HIV genetic variability represents a major obstacle both to infection control by the host's immune system and to the development of efficient drugs and vaccines. CTL cells that recognize epitopes within the HIV antigen group (gag) gene have been associated with early infection control and used in HIV vaccine development approaches. Having that said, the objective of this study was to investigate the variability of HLA class I binding epitopes in the gag gene of HIV-1 strains circulating in Brazil, available in a publicly accessible database. Therefore, the allele variability and predominance of HLA class I in the Brazilian population was determined so that the identification of epitopes of the gag gene of HIV-1 strains circulating in Brazil. For the allele predominance of the HLA, the Allele Frequency Net Database (AFND) was used, as gag regions were removed from through the electronic address https://www.hiv.lanl.gov, with the defined genes (gag) and the alleles most prevalent in the Brazilian population. The Immune Epitope Database (IEDB), using the link tool, was used to determine which are the best Brazilian HLA-linked epitopes. Modeling the protein structure for the antigen with the best identity value was also carried out using the SwissModel program. From this research, a table was generated with the description of the epitopes present in the most circulating subtypes in Brazil according to each previously determined class I HLA allele (HLA-A * 2, A * 24, A * 03, A * 01, A * 68, B * 35, B * 44, B * 15, B * 51 and B * 07), HXB2 and subtypes B, F, and C of HIV-1 and the position of the epitope in relation to the gag gene. As a result, 1320 total epitopes were found, 316 for HXB2, 336, 321, and 302 for subtypes B, F1, and C respectively. From this preliminary analysis, 24 highly conserved candidate epitopes were found between subtypes B, F1 and C. It is important to note that one of the epitopes identified in this study - EPRGSDIAGTTSTL - has not been described in a patent database and in the academic literature until that date. Thus, the variability of HLA class I binding epitopes in the gag gene found in the present study generated data that characterize and describe circulating epitopes in Brazil, contributing to the understanding of the convergence of these epitopes in the world and to the field of research and vaccine development. This study will contribute effectively to assessing the subtype-specific variability of HLA allele-binding epitopes in the genomes of different circulating HIV-1 subtypes and recombinants in Brazil.

Teses
1
  • RAFAEL SHORT FERREIRA
  • EFEITO NEUROPROTETOR DE EXTRATO DICLOROMETANO DE SEMENTES DA Amburana cearensis EM MODELOS DE DANO ISQUÊMICO E DE EXCITOTOXICIDADE GLUTAMATÉRGICA.

  • Orientador : VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DANIEL PENS GELAIN
  • ELISANGELA FABIANA BOFFO
  • FÉLIX ALEXANDRE ANTUNES SOARES
  • SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA
  • VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
  • Data: 20/08/2021

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  • A excitotoxicidade glutamatérgica é um mecanismo fisiopatológico presente em muitas doenças neurodegenerativas crônicas (ex: Doença de Alzheimer) e agudas (ex: acidente vascular cerebral isquêmico – AVEI). Por ter alta densidade populacional de neurônios glutamatérgicos, uma das regiões afetadas neste processo é o hipocampo. Sob estas condições, neurônios e oligodendrócitos podem ser severamente afetados. No entanto, quando ativados, astrócitos podem atuar com agentes captadores de glutamato e atenuar ou impedir morte celular por esse mecanismo. Sabe-se que metabólitos secundários podem proteger desses danos excitotóxicos. Além disto, estudos apontam efeitos promissores relacionados à neuroproteção com extratos da Amburana cearensis em modelos in vitro, sendo a cumarina o agente potencial. O objetivo deste trabalho foi investigar os mecanismos neuroprotetores associados ao tratamento com Extrato Diclorometano da A. cearensis (EDAC). Para isto, dois modelos de AVEI no hipocampo foram utilizados: 1. Fatias de hipocampo de camundongos transgênicos (C57BL/6) (P10), nos quais a expressão da proteína de verde fluorescente (EGFP) é acionada por GFAP em astrócitos ou SOX-10 em oligodendrócitos, submetidas ao pré-tratamento com EDAC por 1 h e depois para condições normais (OGN) ou privação de oxigênio e glicose (OGD) por 1 h na presença ou ausência de EDAC. 2. Culturas organotípicas de fatias de hipocampo (COH) de ratos Wistar do tipo selvagem (P6-8) ou camundongos transgênicos (C57BL/6) GFAP-EGFP tratadas com glutamato e/ou EDAC. Três camadas do cornu ammonis 1 das fatias foram analisadas por imunohistoquímica para anticorpo anti-NeuN, anti-GLT1, anti-GLAST ou anti-GS. A expressão das proteínas foi avaliada por intensidade de fluorescência ou contagem de ramificações ou de células com ramificações de imagens obtidas via microscopia confocal. Os níveis de mRNA de genes de transcrição relacionados à proteção e sobrevivência neural foram avaliados por RT-qPCR. A viabilidade celular foi analisada por captação de iodeto de propídio (intensidade de fluorescência). Nossos resultados mostraram que, em condição de OGD sem reperfusão e em todas 9 camadas avaliadas, o EDAC impediu a redução de processos celulares da expressão de SOX10, sem aumento na expressão de proteínas astrocitárias entre os grupos controle OGN e OGD. Contudo, o EDAC foi capaz de aumentar a expressão de GFAP em condições de OGD. Em COH, observamos que o excesso de glutamato induziu um aumento de morte celular e que esta foi inibida pelo tratamento com EDAC. No entanto, os dados mostram que, nestas condições, o EDAC não protege neurônios. Por outro lado, GFAP, GLT1, GLAST e GS foram superexpressos em culturas tratadas com EDAC sob excitotoxicidade glutamatérgica. Também observamos, por RT-qPCR, um leve aumento da transcrição em GDNF, GLT1, GS, NGF e OLIG2 em fatias de hipocampo tratadas com EDAC. Nossos resultados demonstram que o EDAC tem potencial efeito farmacológico em modelos de isquemia encefálica. Mais estudos precisam ser realizados para melhor elucidar os efeitos observados com o EDAC e quais são os mecanismos de ação do efeito neuroprotetor.


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  • Glutamatergic excitotoxicity is a pathophysiological mechanism present in many chronic (ex: Alzheimer's disease) and acute (ex: ischemic stroke - AVEI) neurodegenerative diseases. Due to its high population density of glutamatergic neurons, one of the regions affected in this process is the hippocampus. Under these conditions, neurons and oligodendrocytes can be severely affected. However, when activated, astrocytes can act with glutamate-capturing agents and attenuate or prevent cell death by this mechanism. Secondary metabolites are known to protect against these excitotoxic damages. In addition, studies show promising effects related to neuroprotection with extracts of Amburana cearensis in in vitro models, with coumarin being the potential agent. The aim of this work was to investigate the neuroprotective mechanisms associated with treatment with A. cearensis Dichloromethane Extract (EDAC). For that, two models of AVEI in the hippocampus were used: 1. Hippocampus slices from transgenic mice (C57BL / 6) (P10), in which the enhanced green fluorescence protein (EGFP) is triggered by GFAP in astrocytes or SOX- 10 in oligodendrocytes, submitted to pretreatment with EDAC for 1 h and then for normal conditions (OGN) or deprivation of oxygen and glucose (OGD) for 1 h in the presence or absence of EDAC. 2. Organotypic cultures of hippocampus slices (COH) from wild-type Wistar rats (P6-8) or transgenic mice (C57BL / 6) GFAP-EGFP treated with glutamate and / or EDAC. Three layers of the cornu ammonis 1 of the slices were analyzed by immunohistochemistry for anti-NeuN, anti-GLT1, anti-GLAST or anti-GS antibody. Protein expression was assessed by fluorescence intensity or count of processes or cells with processes from images obtained via confocal microscopy. The mRNA levels of transcription genes related to neural protection and survival were evaluated by RT-qPCR. Cell viability was analyzed by uptake of propidium iodide (fluorescence intensity). Our results showed that, under OGD condition without reperfusion and in all evaluated layers, EDAC prevented the reduction of cellular processes of SOX10 expression, without increase in astrocytic protein expression between OGN and OGD control groups, but EDAC was able to 11 increase GFAP expression under OGD conditions. However, EDAC was able to increase GFAP expression under OGD conditions. In COH, we observed that glutamate induced an increase in cell death and that it was inhibited by treatment with EDAC. However, the data show that, under these conditions, EDAC does not protect neurons. On the other hand, GFAP, GLT1, GLAST and GS were upregulated in COH treated with EDAC under glutamatergic excitotoxicity. We also observed, by RT-qPCR, a mild transcriptional increase in GDNF, GLT1, GS, NGF and OLIG2 in hippocampal slices treated with EDAC. Our results demonstrate that EDAC has a potential pharmacological effect in models of brain ischemia. More studies need to be carried out to better elucidate the effects observed with EDAC and what are the mechanisms of action of the neuroprotective effect.

2020
Dissertações
1
  • JÉSSICA TELES SOUZA
  • Estudo do efeito da rutina em células neurais em modelo de excitotoxicidade glutamatérgica.

  • Orientador : VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CLARISSA DE SAMPAIO SCHITINE
  • FLAVIA CARLA MEOTTI
  • VICTOR DIOGENES AMARAL DA SILVA
  • Data: 17/02/2020

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  • destaque no âmbito científico devido as suas inúmeras atividades farmacológicas de interesse à saúde humana, incluindo seu potencial neuroprotetor. No contexto das doenças neurodegenerativas, a excitotoxicidade glutamatérgica tem sido apontada como um importante mecanismo de morte neuronal associado a progressão dessas doenças. Portanto, este estudo teve como objetivo investigar a atividade neuroprotetora da rutina para células neurais sob ação citotóxica do glutamato. Para isso, células da linhagem PC12 foram submetidas a diferentes tratamentos: tratamento direto com a rutina (0,5 – 1 μM) e/ou glutamato (10 - 60 mM); tratamento indireto obtido com o uso de meio condicionado da cultura organotípica cerebral de rato Wistar (p7-p9) tratados com a rutina (0,5 μM) e glutamato (60 mM). Em adição, também tratamos cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas com rutina a 0,5 μM. Passadas 24 h dos tratamentos direto e indireto das células PC12, realizamos as análises de viabilidade celular a partir do Teste de exclusão do Azul de Tripan e Iodeto de Propídio. Além disto, realizamos análises morfológicas após coloração de Rosenfeld para as células PC12 e para a cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas. Os resultados obtidos com o teste de viabilidade celular demonstraram que a rutina não foi tóxica para as células PC12. O glutamato, por sua vez, induziu efeito tóxico para as células PC12 de maneira concentração-dependente, sendo que a concentração a 60 mM foi capaz de provocar aproximadamente  100% de morte para as células em cultivo. Em relação aos ensaios de neuroproteção direta, demonstrou-se que a rutina não foi capaz de proteger as células PC12 contra a toxicidade do glutamato em altas concentrações (30 e 60 mM) induzindo cerca de 20% e 100% de morte, respectivamente. Por outro lado, o meio condicionado de cultura organotípica tratada com a rutina (0,5 μM) + glutamato (60 mM) induziu baixa toxicidade para células PC12, mais especificamente apenas 8% das células morreram com o tratamento, enquanto que o tratamento direto apresentou 100% de células mortas. Em relação as alterações morfológicas, o tratamento indireto com meio condicionado de tratamento com rutina induziu mudanças características de diferenciação neuronal para aproximadamente 26% das células em cultivo, diferente do tratamento direto com rutina o qual induziu 2.5%. Estas alterações morfológicas relacionadas ao aumento de pontos de ramificações e ao aumento do comprimento de neuritos também foram observadas em células PC12 sob tratamento indireto e cultura primária de neurônios/células gliais mesencefálicas. Estess resultados indicam um efeito neuroprotetor e morfogênico da rutina que podem estar associados à modulação do metabolismo do glutamato pelos astrócitos e/ ou liberação de fatores solúveis neuroprotetores e indutores de diferenciação neural.


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  • Rutin is one of the most common used polyphenolic compounds described in the literature, with great scientific prominence due to its interesting pharmacological activities for of human health, including its neuroprotective potential. In the context of neurodegenerative diseases, glutamatergic excitotoxicity has been identified as an important mechanism of neuronal death associated with progression of these diseases. Therefore, this study aimed to investigate the rutin neuroprotective activity for neural cells under cytotoxic glutamate action. For this, cells of the PC12 strain were subjected to different treatments: direct treatment with rutin (0.5 - 1 μM) and /or glutamate (10 - 60 mM); indirect treatment using conditioned medium obtained from brain organotypic culture of Wistar rat (p7-p9) treated with rutin (0.5 μM) and glutamate (60 mM). In addition, we also treated primary culture of mesencephalic neurons/glial cells with 0.5 μM rutin. After 24 hours of direct or indirect treatment of PC12 cells, we performed cell viability analyzes from the Trypan Blue and Propidium Iodide exclusion test. In addition, we performed morphological analyzes after Rosenfeld staining for PC12 cells and for primary culture of mesencephalic neurons/glial cells. The results obtained with the cell viability test demonstrated that rutin was not toxic to PC12 cells. Glutamate, in turn, induced a toxic effect in PC12 cells in a concentration-dependent manner, and the concentration at 60 mM was able to cause almost 100% of death to the cells in culture. Regarding the direct neuroprotection assays, it was shown that, compared to the control group that presented 2% death, rutin was not able to protect PC12 cells against glutamate toxicity at high concentrations (30 and 60 mM) inducing about 20% and 100% death respectively. On the other hand, conditioned media from brain organotypic culture treated with rutin- (0.5 μM) + glutamate (60 mM) induced low toxicity in PC12 cultures, more specifically only 8% of cells died with treatment, whereas direct treatment presented 100% dead cells. Regarding morphological changes, indirect treatment with rutin induced a characteristic change in neuronal differentiation for approximately 26% of cells in culture, unlike direct treatment which induced 2.5%. These morphological changes related to the increase of branch points and the increase of neurite length were observed in PC12 cells and in primary culture of mesencephalic neurons/glial cells. These results indicate that the neuroprotective and morphogenic effects of rutin may be associated with modulation of glutamate metabolism by astrocytes and/ or release of soluble neuroprotective and inductors of neural differentiation factors.

2
  • THIAGO MENDONÇA DOS SANTOS

  • POTENCIAL BIOMARCADOR DE PROGRESSÃO PARA MANIFESTAÇÃO DE DOENÇA EM INDIVIDUOS INFECTADOS PELO HTLV-1.

  • Orientador : ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • ANTONIO RICARDO KHOURI CUNHA
  • GLÓRIA REGINA FRANCO
  • Data: 27/02/2020

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  • O Vírus Linfotrópico de Células T do adulto 1 (HTLV-1) é um retrovírus humano sexualmente transmissível que apresenta tropismo preferencial por células T CD4+. Embora a maioria dos indivíduos infectados por esse vírus permaneça assintomática (ASS), as principais manifestações clínicas, como a Mielopatia Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) e a Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATLL), são de difícil prognóstico. A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central que pode culminar com a perda parcial dos movimentos dos membros inferiores ao passo que a ATLL é um tipo de linfoma não-Hodgkin que geralmente leva à morte. Este trabalho tem como objetivo propor um perfil transcricional diferencial, sugestivo das patologias associadas ao HTLV-1, além de investigar as implicações causadas pela desregulação na expressão gênica. Uma metanálise de dez dados de microarranjos disponíveis publicamente foi realizada para identificar genes diferencialmente expressos (GDEs). Foram realizadas análises de vias KEGG enriquecidas. Redes de interação proteína-proteína (IPP), extração de módulos e seleção de genes hubs foram implementados com STRING, MCODE e CytoHubba. Foram identificados ao total 907 GDEs para ATLL, 368 para HAM/TSP e 150 para ASS. A análise KEGG identificou "Vias do câncer" e "Endocitose" como vias enriquecidas para ATLL no conjunto de GDEs superexpresso e subexpresso respectivamente. Não foram obtidas vias enriquecidas significativas para o conjunto total de GDEs de HAM/TSP e ASS. A partir das redes IPP geradas pelo STRING, foram extraídos três módulos para cada uma das manifestações clínicas. Combinando os resultados do MCODE e CytoHubba, cinco genes hub foram identificados para cada condição. Somente ATLL apresentou micro-RNAs diferencialmente expressos, o hsa-mir-21, diretamente envolvido no desenvolvimento da doença e o hsa-mir-6840, ainda pouco conhecido. Este estudo gerou um banco de dados de marcadores genéticos candidatos e vias enriquecidas desreguladas para os status clínicos associados à infecção pelo HTLV-1, o que pode facilitar a definição e a compreensão de biomarcadores terapêuticos prognósticos.


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  • Adult T-cell Lymphotropic Virus 1 (HTLV-1) is a sexually transmitted human retrovirus that exhibits preferential CD4+ T-cell tropism. Although most individuals infected with this virus remain asymptomatic (ASS), the main clinical manifestations such as HTLV-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP) and Adult T-Cell Leukemia/Lymphoma (ATLL) are troublesome conditions. HAM/TSP is an inflammatory manifestation of the central nervous system that may culminate in partial loss of lower limbs movements. ATLL is a type of non-Hodgkin's lymphoma that usually leads to death. This work aims to propose differential transcriptional profile, suggestive of the HTLV-1-associated pathologies, and to investigate the implications of deregulation on gene expression. A meta-analysis of ten publicly available microarray datasets was performed to identify differentially expressed genes (DEGs). Enriched KEGG pathways analysis was performed. Protein-protein interaction (PPI) networks, module extraction and gene hubs selection were implemented with STRING, MCODE and CytoHubba. A total of 907, 368 and 150 DEGs were identified for ATLL, HAM/TSP, and ASS respectively. The KEGG analysis identified "Cancer Pathways" and "Endocytosis" as ATLL-enriched pathways in the set of upregulated and downregulated DEGs respectively. No enriched pathways were identified for the full set of HAM/TSP and ASS DEGs. From the PPI networks generated by STRING, three modules were extracted for each clinical manifestation. Combining the results from MCODE and CytoHubba, five hub genes selected for each condition. Only ATLL presented differentially expressed micro-RNAs: hsa-mir-21, directly involved in the development of the disease and hsa-mir-6840, which is still poorly known. This study generated a database of candidate genetic markers and enriched pathways for the clinical status associated with HTLV-1 infection, facilitating the definition and understanding of prognostic therapeutic biomarkers.

3
  • FERNANDA VIDAL CARVALHO
  • PERFIL METABOLÔMICO E ATIVIDADES ANTIOXIDANTE, CITOTÓXICA E ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DE Lepidium meyenii

  • Orientador : PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ANDERSON DE SOUZA SANT’ANA
  • PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • SILVIA LIMA COSTA
  • Data: 04/06/2020

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  • INTRODUÇÃO: Lepidium meyenii é uma planta que apresenta diversas propriedades medicinais, no entanto, há poucos estudos que correlacionem os metabólitos e as atividades biológicas testadas na planta sob uma perspectiva metabolômica. OBJETIVO: Caracterizar o perfil metabolômico, bem como avaliar as atividades antioxidante, antimicrobiana e citotóxica de extratos obtidos da planta desidratada e de seus produtos comerciais. MATERIAIS E MÉTODOS: Os extratos foram obtidos a partir da raiz da planta e de seus produtos comerciais por maceração em diferentes solventes orgânicos. A atividade antioxidante foi determinada pelo método do sequestro do radical livre 2,2-difenil-1- picril-hidrazil (DPPH) e os fenóis totais foram quantificados pelo método Folin-Ciocalteu. A atividade antimicrobiana foi avaliada frente a bactérias e leveduras através do método de microdiluição em caldo. A citotoxicidade foi avaliada contra a linhagem de células C6 e astrócitos. O perfil metabolômico foi avaliado por cromatografia líquida de alta performance acoplada à espectrometria de massas (CLAE-EM) e cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas (CG-EM). RESULTADOS E DISCUSSÃO: A atividade antioxidante (IC50) variou de 64,97 μg∙mL-1 para o extrato em acetato de etila da raiz da planta desidratada até 935,61 μg∙mL-1 para o extrato em hexano do produto comercial da planta. Os valores de fenóis totais variaram de 6,83 mg∙EAG∙g-1 para o extrato etanólico a 49,83 mg∙EAG∙g-1 para o extrato acetato de etila, ambos os extratos são dos produtos comerciais. Os extratos etanólicos e em acetato de etila foram os mais ativos e apresentaram maior potencial antioxidante, além disso também apresentaram atividade antimicrobiana contra M. luteus e B. cereus e atividade antitumoral contra células C6, não apresentando citotoxicidade aos astrócitos. Foram identificados setenta e seis metabólitos nos extratos e dentre esses, os terpenos foram os principais metabólitos candidatos responsáveis pelas atividades antioxidante e citotóxica e os ácidos graxos pela atividade antibacteriana. CONCLUSÃO: A abordagem metabolômica e a análise estatística multivariada permitiram correlacionar os resultados das atividades biológicas testadas com o perfil químico dos extratos, sendo possível identificar os principais compostos bioativos da L. meyenii relacionados às atividades antioxidante, antimicrobiana e antitumoral da planta. 


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  • INTRODUCTION: Lepidium meyenii is a plant that has several medicinal properties, however, the correlation between the metabolites and the biological activities tested in the plant is limited. OBJECTIVE: To characterize the metabolomic profile as well as to evaluate the antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of extracts obtained from the dehydrated plant and its commercial products and to correlate the metabolomic profile with biological activities. MATERIALS AND METHODS: The extracts were obtained from the root of the plant and its commercial products by maceration in different organic solvents. The metabolomic profile was evaluated by mass performance coupled high chromatography (HPLC-MS) and gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC-MS). The antioxidant activity was determined by the free radical sequestration method 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and total phenols will be quantified by the Folin-Ciocalteu method. Antimicrobial activity was evaluated against bacteria and yeast by broth microdilution method, cytotoxicity was evaluated against C6 cell line and astrocytes. RESULTS AND DISCUSSION: The antioxidant activity (IC50) ranged from 64.97 μg∙mL-1 for the ethyl acetate extract from the root of the dehydrated plant to 935.61 μg∙mL-1 for the hexane extract of the plant commercial product. The total phenol values ranged from 6.83 mg∙GAE∙g-1 for the ethanol extract at 49.83 mg∙GAE∙g-1 for the ethyl acetate extract, both extracts are form the commercial products. The ethanol extracts and ethyl acetate were the most active and had the highest antioxidant potential, in addition they also showed antimicrobial activity against M. luteus and B. cereus and antitumor activity against C6 cells, with no cytotoxicity to astrocytes. Seventy-six metabolites were identified in the extracts and among these, terpenes were the main metabolites responsible for antioxidant and cytotoxic activities and fatty acids for antibacterial activity. CONCLUSION: The metabolomic approach through the several analytical techniques allowed to correlate the obtained results being possible to identify the main bioactive compounds of L. meyenii related to the antioxidant, antimicrobial and antitumor activities of the plant. 

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  • TÁYLA DA CRUZ SANTOS PEREIRA
  • ANÁLISE METABOLÔMICA DO PLASMA DE INDIVÍDUOS COM OSTEONECROSE SECUNDÁRIA À DOENÇA FALCIFORME

  • Orientador : PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ANTONIO GILBERTO FERREIRA
  • ELISANGELA VITORIA ADORNO
  • PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • Data: 29/07/2020

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  • A doença falciforme é a hemoglobinopatia mais frequente no Brasil e constitui problema de saúde pública mundial, com grande impacto na morbimortalidade da população acometida. Em portadores desta patologia a manifestação clínica articular predominante é a osteonecrose, que comumente evolui para doença terminal. Análises relacionadas a metabólitos e vias metabólicas desreguladas, em sistemas complexos, tornou-se uma ferramenta poderosa para investigar processos metabólicos, identificar potenciais biomarcadores e desvendar a reprogramação metabólica em várias doenças. Neste contexto, este trabalho teve como objetivo principal utilizar uma abordagem metabolômica por ressonância magnética nuclear para identificar biomarcadores relacionadas à doença falciforme, bem como, à osteonecrose secundária a doença falciforme. Foi utilizado o plasma sanguíneo de indivíduos controle e de portadores de doença falciforme sem e com osteonecrose. Baseado no estágio clínico da osteonecrose, graduado com o método modificado de Ficat e Arlet, as amostras foram classificadas como estágio inicial, intermediário e avançado de osteonecrose. Para a obtenção dos espectros uni e bidimensionais foi utilizado um equipamento de ressonância magnética nuclear - Bruker Avance III de 14,1 Tesla - (600 MHz). A otimização do protocolo de preparo de amostras e aquisição dos espectros envolveu a utilização de diferentes sequências de pulso; Zg, Zgpr, Lcipnf2, Noesypr 1D bem como alguns protocolos de precipitação de proteínas com metanol. A identificação dos metabólitos foi realizada com o auxílio do software Chenomx NMR Suite 8.4. O processamento e a quantificação foram realizados no software NMRProcflow. As análises estatísticas foram realizadas no software MetaboAnalyst 3.0. Vinte e nove metabólitos foram identificados por RMN 1H, incluindo 12 aminoácidos, 9 ácidos orgânicos, 4 lipídios, 3 compostos orgânicos, 1 carboidrato. O perfil metabólico do plasma sanguíneo do grupo controle foi significativamente distinto dos grupos falcêmico sem osteonecrose e falcêmico com osteonecrose. Vinte metabólitos com VIP score > 0,5 foram responsáveis pelas diferenças entre as amostras destes grupos. O Sn-glicerol-3-fosfocolina e a fenilalanina foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de doença falciforme. O 3-hidroxibutirato e o VLDL+HDL foram os metabólitos com os resultados mais promissores para estudos futuros de biomarcador de osteonecrose secundária à DF. A análise de discriminante também revelou que o plasma dos portadores de osteonecrose secundária à DF em diferentes estágios de osteonecrose apresentam perfis metabólicos distintos. No plasma de sangue periférico quatorze metabólitos com VIP score > 0,5 foram responsáveis por esta diferença. A histidina e lactato foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de estadiamento de osteonecrose secundária à doença falciforme, sobretudo para o diagnóstico precoce desta patologia em plasma de sangue periférico. A histidina, o VLDL + HDL e o citrato foram os metabólitos com os resultados mais promissores para futuras investigações de biomarcador de estágios avançados de osteonecrose secundária à doença falciforme em plasma de sangue periférico. Quinze metabólitos com VIP score > 0,5 foram classificados como o conjunto de metabólitos responsáveis pelas diferenças
    entre o plasma de medula óssea de indivíduos em diferentes estágios de osteonecrose secundária à doença falciforme. O citrato foi o metabólito com o resultado mais promissor para futuras investigações de biomarcador de estadiamento de osteonecrose secundária à doença falciforme, sobretudo para o diagnóstico precoce desta patologia em plasma medula óssea. Já o lactato foi o metabólito com o resultado mais promissor para futuras investigações de biomarcador de estágios avançados de osteonecrose secundária à doença falciforme em plasma medula óssea. A análise topológica de vias metabólicas revelou potencial relação entre doença falciforme e osteonecrose secundária à DF e algumas vias metabólicas, nomeadamente; metabolismo do nitrogênio, do piruvato, da tiamina, da arginina e prolina, da fenilalanina; biossíntese de aminoacil t-RNA, da fenilalanina, da tirosina e triptofano, da valina, leucina e isoleucina; glicólise ou gliconeogênese; degradação de valina, leucina e isoleucina; síntese e degradação de corpos cetônicos. Estes resultados fornecem um forte evidência de uma assinatura metabólica para os indivíduos com doença falciforme e com osteonecrose secundária a DF, definida principalmente por um conjunto de vinte metabólitos com níveis alterados no plasma sanguíneo incluindo, prolina, lactato, creatina + creatinina, 2-hidroxi-3-metilbutírico, fenilalanina, glicina, acetona, formato, citrato, glicose trimetilamiona-n-óxido, histidina, tirosina, azelato, 3-hidroxibutirato, leucina + isoleucina, sn-glicerol-3-fosfocolina e acetato. Espera-se, que estes achados, ajudem a nortear futuras pesquisas na área e possa elucidar, ainda mais, as alterações bioquímicas na doença falciforme e na osteonecrose secundária a DF.


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  • Sickle cell disease is the most common hemoglobinopathy in Brazil and constitutes a worldwide public health problem, with a great impact on the morbidity and mortality of the affected population. In patients with this pathology, the predominant joint clinical manifestation is osteonecrosis, which commonly progresses to terminal disease. Analyzes related to metabolites and unregulated metabolic pathways in complex systems have become a powerful tool for investigating metabolic processes, identifying potential biomarkers and unraveling metabolic reprogramming in various diseases. In this context, this work had as main objective to use a metabolic approach by nuclear magnetic resonance to identify biomarkers related to sickle cell disease, as well as to osteonecrosis secondary to sickle cell disease. Blood plasma from control subjects and patients with sickle cell disease with and without osteonecrosis was used. Based on the clinical stage of osteonecrosis, graduated using the modified Ficat and Arlet method, the samples were classified as early, intermediate and advanced stages of osteonecrosis. To obtain the uni and bidimensional spectra, a nuclear magnetic resonance equipment - Bruker Avance III of 14.1 Tesla - (600 MHz) was used. The optimization of the sample preparation and spectrum acquisition protocol involved the use of different pulse sequences; Zg, Zgpr, Lcipnf2, Noesypr 1D as well as, some protocols for protein precipitation with methanol. The identification of the metabolites was performed with the aid of the Chenomx NMR Suite 8.4 software. Processing and quantification were performed using the NMRProcflow software. Statistical analyzes were performed using MetaboAnalyst 3.0 software. Twenty-nine metabolites were identified by 1H NMR, including 12 amino acids, 9 organic acids, 4 lipids, 3 organic compounds, 1 carbohydrate. The metabolic profile of the blood plasma of the control group was significantly different from the sickle cell groups without osteonecrosis and the sickle cell group with osteonecrosis. Twenty metabolites with VIP score > 0.5 were responsible for the differences between samples in these groups. Sn-glycerol-3-phosphocholine and phenylalanine were the metabolites with the most promising results for future investigations of the sickle cell disease marker. 3-hydroxybutyrate and VLDL + HDL were the metabolites with the most promising results for future studies of osteonecrosis biomarker secondary to DF. The discriminant analysis also revealed that the plasma of patients with osteonecrosis secondary to DF at different stages of osteonecrosis has different metabolic profiles. In the peripheral blood plasma, fourteen metabolites with VIP score > 0.5 were responsible for this difference. Histidine and lactate were the metabolites with the most promising results for future investigations of osteonecrosis staging biomarkers secondary to sickle cell disease, especially for the early diagnosis of this pathology in peripheral blood plasma. Histidine, VLDL + HDL and citrate were the metabolites with the most promising results for future investigations of biomarker of advanced stages of osteonecrosis secondary to sickle cell disease in peripheral blood plasma. Fifteen metabolites with VIP score > 0.5 were classified as the set of metabolites
    responsible for the differences between the bone marrow plasma of individuals in different stages of osteonecrosis secondary to sickle cell disease. Citrate was the metabolite with the most promising result for future investigations of osteonecrosis staging biomarkers secondary to sickle cell disease, especially for the early diagnosis of this pathology in bone marrow plasma. Lactate was the metabolite with the most promising result for future investigations of biomarker of advanced stages of osteonecrosis secondary to sickle cell disease in bone marrow plasma. The topological analysis of metabolic pathways revealed a potential relationship between sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF and some metabolic pathways, namely; metabolism of nitrogen, pyruvate, thiamine, arginine and proline, phenylalanine; biosynthesis of aminoacyl t-RNA, phenylalanine, tyrosine and tryptophan, valine, leucine and isoleucine; glycolysis or gluconeogenesis; degradation of valine, leucine and isoleucine; synthesis and degradation of ketone bodies. These results provide strong evidence of a metabolic signature for individuals with sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF, defined mainly by a set of twenty metabolites with altered blood plasma levels including, proline, lactate, creatine + creatinine, 2-hydroxy -3-methylbutyric, phenylalanine, glycine, acetone, format, citrate, glucose, trimethylamione-n-oxide, histidine, tyrosine, azelate, 3-hydroxybutyrate, leucine + isoleucine, sn-glycerol-3-phosphocoline and acetate. It is hoped that these findings will help to guide future research in the area and may further elucidate the biochemical changes in sickle cell disease and osteonecrosis secondary to DF.

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  • VICTOR DE BARROS SERRANO NEVES
  • microRNA COMO BIOMARCADORES PARA IDENTIFICAÇÃO DE INDIVÍDUOS COM PRÉ-DIABETES E DIAGNÓSTICO PRECOCE DO DIABETES.

  • Orientador : SIMONE GARCIA MACAMBIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • CAROLINA KYMIE VASQUES NONAKA
  • GLÓRIA REGINA FRANCO
  • SIMONE GARCIA MACAMBIRA
  • Data: 04/08/2020

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  • Introdução: O diabetes mellitus (DM) é uma doença crônica decorrente de defeitos na produção, secreção ou sinalização da insulina. Pré-diabetes é um estado sem sintomas onde o indivíduo apresenta níveis de glicemia de jejum entre 100 - 120mg/dl e hemoglobina glicada entre 5,7 e 6,5%. Antes definido como um estado latente, atualmente é definido como um período de risco para nefropatia, neuropatia e destruição das células β-pancreáticas. Neste contexto, torna-se relevante a identificação de marcadores biológicos, tais como microRNA (miRNA), para este estado patológico contribuindo para o diagnóstico precoce. Os miRNA são pequenos RNA que não codificam proteínas, mas são considerados importantes reguladores pós-transcricionais. São apontados como potenciais biomarcadores, uma vez que tem seus níveis de expressão alterados em função do desenvolvimento ou do grau de severidade de diversas doenças como diabetes, câncer e esquizofrenia. No presente estudo, visamos identificar um perfil de expressão de miRNA que pode viabilizar o diagnóstico precoce do pré-diabetes. Resultados: Após o levantamento dos transcriptomas publicamente disponíveis em NCBI GEO dataset, um transcriptoma atendeu aos critérios de inclusão deste estudo. A partir deste, foram identificados trinta e três miRNA com perfil de expressão aumentado no grupo pré-diabético em relação ao controle (FC≥1,5 p-valor≤ 0,05) e dois no grupo diabético (FC≥1,5 p-valor≤ 0,05). A rede de interação gerada pelo programa Cytoscape mostrou os miRNAs selecionados e seus alvos diferencialmente expressos no transcriptoma de validação. Cinco destes miRNA apresentaram maiores valores de centralidade na rede de interação miRNA-mRNA (let-7a, Let-7b, miR-106b, miR-93 e miR-17). Estes miRNA apresentaram maior sensibilidade e especificidade para o pré-diabetes (AUC = 0,794). Conclusão: Os cinco miRNA identificados estão envolvidos em diversas vias intracelulares relacionadas à resistência insulínica e destruição das células β-pancreática e estão diferencialmente modulados no transcriptoma analisado neste estudo, podendo ser apontados como biomarcadores exploratórios promissores para diagnóstico precoce de DM2.


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  • Introduction: Diabetes Mellitus (DM) is a chronic disease developed by defects in insulin signaling, secretion or production. Prediabetes is a asymptomatic state in which subjects fasting glucose is between 100-120mg/dl and glycated hemoglobin is at the range of 5,7-6,5%. Defined before as a latent state it is now known that is a risk factor for nephro and neuropathy development and also increase in β-cell destruction. In this context, becomes necessary the identification of biological markers that presents a disrupted expression due to the pathological state thus contributing to an early diagnostic. miRNAs are non-coding RNA considered important in the pos-translation regulation of genes. They are pointed out as potential biomarkers, since their expression level becomes altered due to the development or aggravation of many diseases such as diabetes, cancer and schizophrenia. The present study aimed to identify an expression microRNA (miRNA) profile capable of confer early prediabetes diagnostic. Publicly available transcriptome was analyzed through bioinformatic tools. Results: After screening conducted at NCBI GEO datasets, one transcriptome matched our inclusion criteria. From which thirty-three miRNA were significatively upregulated in prediabetic subjects versus control (FC>1,5 p-valor≤ 0,05) and two were upregulated in the diabetix cersus control group (FC>1,5 p-valor≤ 0,05) A miRNA-mRNA network was created using the upregulated miRNA and its regulated targets in the validation transcriptome using the Cytoscaped software. Five miRNAs presented a greater centrality score from the miRNA-mRNA network. In which two (miR-93 and Let-7a) had better values for sensibility and specificity (AUC =0,829 e 0,824 respectively). Conclusion: The five miRNA identified are involved in several intracellular pathways related to insulin resistance and destruction of β-pancreatic cells and are differentially modulated in the transcriptome analyzed in this study, which can be identified as promising exploratory biomarkers for the early diagnosis of DM2.

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  • NATAN RODRIGUES SANTANA DA HORA
  • AVALIAÇÃO METABOLÔMICA E ATIVIDADE ANTIOXIDANTE, CITOTÓXICA E ANTIMICROBIANA DE EXTRATOS DO ESTIGMA DE Zea mays L.

  • Orientador : PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • DÉBORAH YARA ALVES CURSINO DOS SANTOS
  • LOURDES CARDOSO DE SOUZA NETA
  • PAULO ROBERTO RIBEIRO DE JESUS
  • Data: 16/11/2020

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  • INTRODUÇÃO: O estigma de milho é a flor feminina de Zea mays L., bem conhecida pela medicina tradicional chinesa. A literatura científica relata suas atividades farmacológicas, mas são poucos os estudos científicos que realizam um mapeamento químico global, e correlacionam os metabólitos com as atividades biológicas investigadas, por meio de uma metabolômica. OBJETIVO: Caracterizar o perfil metabolômico e as atividades antioxidante, antimicrobiana e citotóxica de extratos do estigma de Zea mays L. in natura e seu produto comercial. MATERIAIS E MÉTODOS: Os extratos foram obtidos a partir do estigma do milho, por maceração em diferentes solventes, como hexano, acetato de etila e etanol. A atividade antioxidante foi fornecida pelo método de sequestro de radicais livres 2,2-difenil-1-picril-hidrazil (DPPH) e os fenóis totais foram quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu. A atividade antimicrobiana foi avaliada pelo método de microdiluição em caldo contra bactérias Gram-positivas e Gram-negativas, além de fungos não filamentosos. A citotoxicidade foi avaliada contra uma linha tumoral de glioma de camundongo (C6), através da análise da viabilidade celular avaliada pelo método de redução do brometo de 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT). O perfil metabolômico foi avaliado por cromatografia líquida de alta eficiência acoplada a espectrometria de massas (CLAE-EM) e cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-EM). Na análise univariada, foram utilizadas análises de variância (ANOVA), plotagem de vulcão e análise de correlação. Na análise multivariada os métodos foram o PLS-DA, VIP e o mapa de calor. Em geral, os extratos etanólicos apresentam melhor atividade antioxidante e maiores valores de fenóis totais. RESULTADOS E DISCUSSÃO: A atividade antioxidante (IC50) variou de 77,44 μg.mL-1 para o extrato etanólico do estádio reprodutivo 1 (E1R1) até 950, 31 μg.mL-1 para o extrato hexânico do produto comercial (CH). Os valores de fenóis totais variaram de 12, 95 mg.EAG.g-1 para extrato etanólico com etanol de produto comercial a 46, 14 mg.EAG.g-1 para extrato etanólico no estádio reprodutivo 1. O extrato com acetato de etila estádio reprodutivo 1 (EAR1) apresentou melhor atividade antibacteriana contra Bacillus subtilis e Pseudomonas aeruginosa (500 μg.mL-1). O extrato EAR1 apresentou maior atividade citotóxica, pois conseguiu diminuir a viabilidade da linhagem tumoral C6 (100 μg.mL-1) em 40,74%. Foram identificados trinta metabólitos. Os ácidos orgânicos, carboidratos e uma saponina têm maior correlação com a atividade antioxidante; citotóxica e antimicrobiana. CONCLUSÃO: Embora alguns estudos apresentem as atividades biológicas dos extratos de Zea Mays L., este foi o pioneiro em apresentar uma avaliação metabolômica global de extratos com diferentes polaridades e correlacionar os resultados das atividades antioxidante, citotóxica e antitumicrobiana com os metabólitos localizados nos extratos. Além disso, foi identificada a influência de solventes, estádios fenológicos e natureza natural e comercial na variação do metaboloma e sugerindo os principais metabólitos responsáveis por influenciar maiores atividades biológicas.


  • Mostrar Abstract
  • INTRODUCTION: The stigma of corn is the female flower of Zea mays L., well known for traditional Chinese medicine. The scientific literature reports its pharmacological activities, but there are few scientific studies that perform a global chemical mapping, and correlate metabolites with the investigated biological activities, by means of a metabolomic. OBJECTIVE: To characterize the metabolomic profile and the antioxidant, antimicrobial and cytotoxic activities of extracts of the stigma of Zea mays L. in natura and its commercial product. MATERIALS AND METHODS: The extracts were obtained from the stigma of corn, by maceration in different solvents, such as hexane, ethyl acetate and ethanol. The antioxidant activity was provided by the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl free radical sequestration method (DPPH) and the total phenols were quantified by the Folin-Ciocalteu method. The antimicrobial activity was evaluated by the microdilution method in broth against Gram-positive and Gram-negative bacteria, besides non filamentous fungi. The cytotoxicity was evaluated against a tumoral line of mouse glioma (C6), through the analysis of the cellular viability evaluated by the method of 3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium (MTT) bromide reduction. The metabolic profile was evaluated by high efficiency liquid chromatography coupled to mass spectrometry (CLAE-EM) and gas chromatography coupled to mass spectrometry (CG-EM). In the univariate analysis, analysis of variance (ANOVA), volcano plotting and correlation analysis were used. In multivariate analysis the methods were PLS-DA, VIP and heat map. In general, the ethanolic extracts present better antioxidant activity and higher values of total phenols. RESULTS AND DISCUSSION: The antioxidant activity (IC50) varied from 77.44 μg.mL-1 for the ethanolic extract of reproductive stage 1 (E1R1) to 950, 31 μg.mL-1 for the hexanic extract of commercial product (CH). Total phenol values ranged from 12, 95 mg.EAG.g-1 for ethanolic extract of commercial product to 46, 14 mg.EAG.g-1 for ethanolic extract of reproductive stage 1. The extract with ethyl acetate reproductive stage 1 (EAR1) showed better antibacterial activity against Bacillus subtilis and Pseudomonas aeruginosa (500 μg.mL-1). The EAR1 extract presented higher cytotoxic activity, because it was able to reduce the viability of the C6 tumor lineage (100 μg.mL-1 ) by 40.74%. Thirty metabolites were identified. The organic acids, carbohydrates and a saponin have greater correlation with the antioxidant activity; cytotoxic and antimicrobial. CONCLUSION: Although some studies present the biological activities of Zea Mays L. extracts, this was the pioneer in presenting an overall metabolic evaluation of extracts with different polarities and correlating the results of antioxidant, cytotoxic and antitumicrobial activities with the metabolites located in the extracts. In addition, the influence of solvents, phenological stages and natural and commercial nature on the variation of the metabolome were identified and suggesting the main metabolites responsible for influencing greater biological activities.

Teses
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  • PÂMELA SANTANA DALTRO
  • “Avaliação do potencial terapêutico das células mesenquimais e do meio condicionado no tratamento das disfunções cardíacas decorrentes da obesidade e do diabetes mellitus tipo 2."

  • Orientador : SIMONE GARCIA MACAMBIRA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ELISALVA TEIXEIRA GUIMARÃES
  • GYSELLE CHRYSTINA BACCAN
  • LUCIANA SOUZA DE ARAGAO FRANCA
  • NATALIA MACHADO TAVARES
  • SIMONE GARCIA MACAMBIRA
  • Data: 14/02/2020

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  • Hábitos alimentares com altos teores de gordura e o estilo de vida sedentário são fatores desencadeantes da obesidade, diabetes tipo 2 (DM2) e insuficiência cardíaca. Células mesenquimais (MSC) surgem como uma ferramenta terapêutica capaz de melhorar o quadro de doenças cardiovasculares, mas também de outras condições degenerativas, devido ao seu efeito regenerativo induzido pela sua ação parácrina. Com base nisso, os fatores secretados no meio condicionado (MC) destas células também são investigados na regeneração tecidual. Assim, este estudo visou avaliar o potencial terapêutico das MSC e do seu MC no tratamento das complicações cardíacas em modelo experimental de obesidade e diabetes induzidas por dieta com alto teor de gordura (HFD). Avaliações bioquímicas, murinométricas e funcionais cardíacas foram realizadas nos períodos: pré-indução da obesidade, pós-indução e pós-tratamento. Após 36 semanas de uso de dieta HFD, esta foi substituída pela dieta padrão e seguida pelo tratamento: MSC, MC e DMEM (veículo). A disfunção metabólica foi avaliada através de parâmetros bioquímicos e índice de massa corpórea. A função cardíaca foi avaliada por eletrocardiografia, ecocardiografia e teste ergométrico. Mecanismos moleculares de ação da tersapia foram investigados utilizando qRT-PCR em tecido cardíaco e a presença de fibrose por análise histopatológica do tecido cardíaco. A caracterização do MC foi feita por protein array revelou a presença de 19 proteínas incluindo citocinas e fatores de crescimento. Os camundongos alimentados com HFD apresentaram arritmias cardíacas, expressão alterada de genes cardíacos e fibrose do miocárdio, refletindo na redução da capacidade de atividade física. A administração de MSC ou MC reverteu as arritmias e recuperou a capacidade de realizar exercício físico. Na primeira etapa deste estudo, observou-se a melhora funcional cardíaca em consonância com a normalização da expressão dos genes GATA4, conexina 43 e COL1A1 nos corações de camundongos tratados com MSC ou MC. Por outro lado, a expressão dos genes troponina I, adiponectina, TGFβ, PPARγ, IGF-1, SOCS3, MMP9 e TIMP1 normalizaram após o tratamento com MSC, mas não com o MC. Além disso, a administração de MSC ou MC reduziu o percentual de área com fibrose. A fim de elucidar a significativa melhora alcançada pelas MSC, na segunda etapa deste estudo, aprofundou-se a investigação acerca dos mecanismos moleculares envolvidos neste efeito terapêutico. Foi investigada a expressão de genes relacionados ao remodelamento tecidual (SPARC e CTGF), à apoptose (SMAD7 e PDCD4), à inflamação (CCl2 e CHI3I3), bem como, à sobrevivência e proliferação celular (PTEN e STAT3) por qRT-PCR. Elevados níveis da expressão gênica do SMAD7, PDCD4, SPARC, CTGF, CCL2, STAT3 e PTEN foram detectados apenas no grupo tratado com MSC, enquanto que no CHI3I3 e no NPPA a expressão gênica estava reduzida tanto nos camundongos tratados com MSC quanto nos tratados com DMEM. Os resultados sugerem que as MSC e o MC possuem um efeito terapêutico sobre as alterações cardíacas decorrentes da obesidade e DM2, sendo os fatores relacionados ao desenvolvimento da fibrose, apoptose e à sobrevivência celular modulados, demonstrando a relevância dos fatores secretados pelas MSC reforçando sua ação parácrina.


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  • Eating habits with high fat levels and sedentary lifestyle are triggers factors for obesity, type 2 diabetes (DM2), and heart failure. Mesenchymal stem cells (MSC) arise as a therapeutic tool capable of improving cardiovascular disease, but also of other degenerative conditions, due to its regenerative effect induced by its paracrine action. Based on this, the factors secreted in the conditioned medium (CM) of this cells are also investigated in tissue regeneration. Therefore, this study aimed to evaluate the therapeutic potential of MSC and its CM in the treatment of cardiac complications in an experimental model of obesity and diabetes induced by high fat diet (HFD). Cardiac, murinometric and biochemistry evaluations were done at different periods such as pre-indcution, pos-induction and pos-treatment. After 36 weeks of HFD administration this diet were replaced by the standard diet and then mice were treated with MSC, MC and DMEM (vehicle). Cardiac function was assessed by electrocardiography, echocardiography, and treadmill test. Metabolic dysfunction was assessed through measurements of body weight and biochemical parameters. Molecular mechanisms of action of the treatment were investigated using qRT-PCR in cardiac tissue. The presence of cardiac fibrosis were evaluated by histopathological analysis. The characterization of MC by protein array showed the presence of 19 proteins including cytokines and growth factors. Mice fed HFD developed cardiac arrhythmias, expression alterations of cardiac genes and myocardial fibrosis, reflecting in the reduction of physical activity due to obesity and DM2. Administration of MSC or CM improved the severity arrhythmias and recovery exercise capacity. The first part of this study the improvement of cardiac function was in agreement with the expression normalization of GATA4, conexin 43 e COL1A1  genes in HFD mice treated with MSC ou MC. By other side the gene expression of troponin I, adiponectin, TGFβ, PPARγ, IGF-1, SOCS3, MMP9 and TIMP1 were normalized only after MSC treatment, but not with CM. Moreover, MSC or CM administration reduced the intensity of cardiac fibrosis. In order to elucidate the significant improvement achieved by MSC, in the second stage of this study, the investigation on the molecular mechanisms involved in this therapeutic effect. The expression of genes related to tissue remodeling (SPARC and CTGF), apoptosis (SMAD7 and PDCD4), inflammation (CCl2 and CHI3I3), as well as cell survival and proliferation (PTEN and STAT3) by qRT-PCR were investigated. High levels of gene expression of SMAD7, PDCD4, SPARC, CTGF, CCL2, STAT3 and PTEN were detected only in the MSC-treated group, whereas in CHI3I3 and NPPA gene expression was reduced in both MSC-treated and DMEM-treated mice. The results suggest that MSC and MC have a therapeutic effect on cardiac alterations due to obesity and T2DM, being the factors related to the development of fibrosis, apoptosis and cell survival modulated, demonstrating the relevance of the factors secreted by MSC reinforcing their action paracrine.

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  • JÉSSICA LAIS ALMEIDA DOS SANTOS
  • INFECÇÃO PELO HTLV-1 E PROGRESSÃO PARA HAM/TSP:

    CONTRIBUIÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES HUMANOS E VIRAIS

  • Orientador : ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • GISELLE CALASANS DE SOUZA COSTA
  • MARIA FERNANDA DE CASTRO AMARANTE
  • MARIA LUIZA SARAIVA PEREIRA
  • Data: 16/12/2020

  • Mostrar Resumo
  • O vírus linfotrópico de células T humana do tipo 1 (HTLV-1) é um retrovírus humano sexualmente transmissível, cujas principais manifestações clínicas são a Mielopatia Associada ao HTLV/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP) e a Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATLL). A HAM/TSP é uma manifestação inflamatória do sistema nervoso central que pode resultar na perda parcial dos movimentos dos membros inferiores. Embora muitos aspectos dos eventos que levam ao desenvolvimento de doença não estejam esclarecidos, a resposta imune do hospedeiro, principalmente a resposta celular desencadeada por células T CD8+ específicas, é reconhecida como um evento crucial. O objetivo desse trabalho é investigar marcadores moleculares no vírus e no hospedeiro que possam estar relacionaodos à manifestação de doença, principalmente a HAM/TSP. No Capítulo I, foi realizada a busca por marcadores virais, no que diz respeito à apresentação diferencial de epítopos, para os diferentes perfis clínicos. Para tanto, fizemos um levantamento (Genbank) de 46 genomas completos do HTLV-1, e separamos as regiões codificantes das proteínas Tax, HBZ, p12, gp21 e gp46. Tais regiões gênicas foram traduzidas, e avaliadas quanto a presença de SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). Os referidos SNPs foram representados em sequências de AA que foram submetidas ao IEDB (Immune Epitope Database a Analysis Resource) para predição de epítopos lineares ligantes de moléculas de HLA-I. Foi possível identificar 7 “alelos protéicos” para a proteína gp21, 23 para gp46, 20 para HBZ, 13 para a proteína Tax, e 15 para a proteína p12, todos distruídos entre indivíduos ASS, fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Esporádico) e ATLL. Na predição, foram identificados mais de 15.741 epítopos para p12, menor quantidade de epítopos preditos e mais de 50.000 para Tax, com a maior quantidade de epítopos preditos. A proteína p12 teve a maior proporção de epítopos específicos, também seguida pela proteína Tax. A proteína HBZ teve os menores percentuais em todas as faixas de especificidade. Os resultados encontrados para as proteínas estruturais gp46 e gp21 foram semelhantes. Não houve nenhuma especificidade/exclusividade dos alelos de HLA entre as proteínas, “alelos protéicos” e/ou perfis clínicos do hospedeiro. Cada proteína apresentou um alelo de HLA como sendo o mais frequente entre os “alelos protéicos”, não havendo similaridade nessa ocorrência. E por fim, o alelo de HLA*A 32:01 foi citado entre os mais frequentes em todas as proteínas, e as proteínas gp21 e HBZ apresentaram perfis semelhantes no que se refere à ocorrência dos alelos de HLA mais frequentes. O perfil clínico HAM/TSP foi o que apresentou o maior número de variações moleculares entre as proteínas estudadas: foram 42 “alelos protéicos” contra 19 de indivíduos com ATLL e 16 de indivíduos ASS (Não HAM/TSP). Os achados de afinidade revelaram que dos 9 epítopos que apresentaram diferenças na afinidade às moléculas de HLA, 6 deles estavam associados a indivíduos ATLL, 4 a indivíduos sHAM/TSP e 2 a indivíduos ASS. Concluimos não haver um perfil de apresentação de epítopos que esteja associado ao status clínico do hospedeiro, uma vez que houve grande semelhança quanto aos alelos de HLA e quanto à posição dos epítopos apresentados entre os “alelos protéicos”. No entanto, identificamos variações moleculares importantes na predição dos epítopos especialmente nos genomas de indivíduos com ATLL e HAM/TSP. No Capítulo II, buscamos por marcadores no hospedeiro, em um grupo de indivíduos (HAM/TSP e assintomáticos) (N=44) infectados. Para tanto, realizamos a determinação do Exoma através da Plataforma Illumina e utilizando um chip para 551.004 SNPs. A taxa total de genotipagem das amostras foi de 0,997001, com perda de 35.163 SNPs (~6%), identificadas 515.841 variantes. A determinação ancestral revelou uma proporcionalidade de contribuição genética mais marcante para a origem africana na população estudada. Observamos predominância de mulheres no grupo caso, como já foi documentado na literatura. A média de idade dos indivíduos infectados foi de 59 anos (27-89 anos), sendo que a carga proviral média destes é de 55.253,41/106 células. Dentre os SNPs identificados, quatro deles se destacaram quanto às frequências alélicas nos grupos caso e controle, e são eles: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C e rs376863_A. Após análise de regressão multivariada, ajustada para ancestralidade, apenas os SNPs “rs1265564” (p=7,2*10-4) e “rs376863” (p=1,25*10-3) se apresentam associados ao desfecho. O SNP rs1265564, foi identificado no gene que codifica para a proteína CUX-2 que está associada ao reparo de DNA oxidado por ação das espécies reativas do oxigênio produzidas nos neurônios. Os quatro SNPs iniciais mostram estar em desequilíbrio de ligação com outros SNPs, porém nenhum deles dos já descritos na literatura e citados neste trabalho. Sugerimos uma busca minuciosa dos SNPs indicados neste trabalho, bem como a associação de marcadores moleculares do hospedeiro com marcadores virais, como forma de entender o processo de infecção e manifestação de doença como resultado de uma integração complexa e bem sucedida.


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  • Human T-cell lymphotropic virus type 1 (HTLV-1) is a sexually transmitted human retrovirus. Its main clinical manifestations are HTLV-Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP) and T-Cell Leukemia / Lymphoma of the Adult (ATLL). HAM/TSP is an inflammatory disorder of the central nervous system that can result in partial loss of lower limb movements. Although many events aspects that lead to the disease development are unclear, the host's immune response, especially the cellular response triggered by specific CD8+ T cells, is recognized as a crucial event. The objective of this work is to investigate molecular markers in the virus and in the host that may be related to the manifestation of the disease, mainly HAM/TSP. In Chapter I we have search for viral markers, with regard to the differential epitope presentation, for the different clinical profiles. We carried out a survey (Genbank) of 46 HTLV-1 complete genomes, and separated the coding regions of Tax, HBZ, p12, gp21 and gp46 proteins. Such gene regions were translated and evaluated for the presence of SNPs (Single Nucleotide Polymorphism). These SNPs were represented in AA sequences that were submitted to the IEDB (Immune Epitope Database Analysis Resource) to predict linear epitopes linking HLA-I molecules. It was possible to identify 7 “protein alleles” for the gp21 protein, 23 for gp46, 20 for HBZ, 13 for the Tax protein, and 15 for the p12 protein, all distributed among individuals ASS, fHAM/TSP (Familiar), sHAM/TSP (Sporadic) and ATLL. In prediction results, more than 15,741 epitopes were identified for p12, the lowest amount of predicted epitopes and more than 50,000 for Tax, with the highest amount of predicted epitopes. The p12 protein had the highest proportion of specific epitopes, also followed by the Tax protein. The HBZ protein had the lowest percentages in all specificity ranges. The results found for structural proteins gp46 and gp21 were similar. There was no specificity/exclusivity of HLA alleles among proteins, "protein alleles" and/or host clinical profiles. Each protein presented an HLA allele as being the most frequent among the “protein alleles”, with no similarity in this occurrence. Finally, the HLA * A 32:01 allele was cited as the most frequent in all proteins, and the gp21 and HBZ proteins showed similar profiles with regard to the occurrence of the most frequent HLA alleles. The HAM/TSP clinical profile showed the highest number of molecular variations among the studied proteins: there were 42 “protein alleles” against 19 of individuals with ATLL and 16 of ASS individuals (Non-HAM/TSP). The affinity findings revealed that 9 epitopes showed differences in affinity to HLA molecules, 6 of them were associated with ATLL individuals, 4 with sHAM/TSP individuals and 2 with ASS individuals. We conclude that there is no epitope presentation profile that is associated with the host clinical status, since there was great similarity in the HLA alleles and in the predicted epitopes positions among the “protein alleles”. However, we have identified important molecular variations in the epitopes prediction, especially in the genomes of individuals with ATLL and HAM/TSP. In Chapter II, we looked for markers in the host, in a group of infected individuals (HAM/TSP and asymptomatic) (N = 44). For this, we have performed the determination of Exoma through the Illumina Platform and using a chip for 551,004 SNPs. The overall  genotyping rate of samples was 0.997001, with a loss of 35,163 SNPs (~ 6%), identified 515,841 variants. The ancestral determination revealed a proportionality of genetic contribution more marked for the African origin in the studied population. We observed a predominance of women in the case group, as has already been documented in the literature. The average age of infected individuals was 59 years (27-89 years), with an average proviral load of 55,253.41/106 cells. Among the SNPs identified, four of them stood out regarding the allele frequencies in the case and control groups, and they are: rs2857596_C, rs7917905_A, rs1265564_C and rs376863_A. After multivariate regression analysis, adjusted for ancestry, only the SNPs “rs1265564” (p = 7.2 * 10-4) and “rs376863” (p = 1.25 * 10-3) are associated with the outcome. The SNP rs1265564, was identified in the gene that codes for the CUX-2 protein that is associated with the repair of oxidized DNA by the action of reactive oxygen species produced in neurons. The initial four SNPs show to be in linkage disequilibrium with other SNPs, but none of those already described in the literature and cited in this work. We suggest a thorough search for the SNPs indicated in this work, as well as the association of host molecular markers with viral markers, as a way of understanding the process of infection and disease manifestation as a result of a complex and successful integration.

2019
Dissertações
1
  • JÉSSICA DUARTE SOUSA
  • Superóxido Dismutase Tipo 1 como Potencial Alvo Terapêutico para a Leucemia/Linfoma de Células T de Adulto, patologia associada à infecção pelo Vírus Linfotrópico de Células T Humanas Tipo 1

  • Orientador : ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • MEMBROS DA BANCA :
  • ALINE CRISTINA ANDRADE MOTA MIRANDA MASCARENHAS
  • ANDREA THOMPSON DA POIAN
  • LUCIANE AMORIM SANTOS
  • Data: 03/05/2019

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  • INTRODUÇÃO: O mecanismo dos tratamentos secundários, como a utilização de antioxidantes e de interferon (IFN) tipo 1, para a patologia associada ao Vírus Linfotrópico de Células T Humanas do tipo 1 (HTLV-1), Mielopatia Associada ao HTLV-1/Paraparesia Espástica Tropical (HAM/TSP), ainda não é completamente elucidado, mas baseia-se na proteção contra as Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). A enzima Superóxido Dismutase do tipo 1 (SOD1) catalisa a dismutação dos radicais superóxido e é importante para a sobrevivência do HTLV-1 no meio intracelular. Mecanismos inibitórios dessa enzima, como através do dietilditiocarbamato (DETC), poderia aumentar a concentração intracelular de superóxido, desencadeando estresse oxidativo e induzindo a morte celular por apoptose. Dessa forma, a regulação dos radicais superóxido em linfócitos infectados, através da atividade antioxidante de SOD1, poderia ser um alvo terapêutico para a Leucemia/Linfoma de Células T do Adulto (ATLL), outra patologia também associada ao HTLV-1. OBJETIVO: Investigar a enzima antioxidante SOD1 como um potencial alvo terapêutico para ATLL; e seu inibidor, DETC, como uma terapia pro-oxidante promissora para essa patologia. MATERIAL E MÉTODOS: O banco de dados Gene Expression Omnibus (GEO) foi utilizado para a busca por conjuntos de dados de expressão gênica associados às formas clínicas da ATLL (indolente, crônica, linfomatosa e aguda). A metanálise dos dados foi realizada utilizando o software Ingenuity Pathway Analysis (IPA). A concentração plasmática de SOD1 em indivíduos infectados sintomáticos (ATLL e HAM/TSP), portadores assintomáticos e indivíduos saudáveis não infectados foi avaliada por ensaio de imunoabsorção enzimática ELISA Cu/Zn-SOD. Linhagens de linfócitos T, MT2 e MT4, foram utilizadas nos ensaios in vitro para avaliação da concentração citoplasmática basal de SOD1, por ELISA Cu/Zn-SOD; e para avaliação da inibição de SOD1 por DETC. A capacidade apoptótica do DETC e a validação da sua ação, pelo uso do antioxidante N-acetilcisteína (NAC) foram avaliadas por citometria de fluxo e quantificada por coloração com Hoechst 33432. RESULTADOS E DISCUSSÃO: Nas formas clínicas crônica e aguda da ATLL, observamos que o gene NFE2L2, relacionado à regulação da resposta antioxidante, está sendo diferencialmente expresso, sob regulação positiva, e que a via clássica de proliferação de linfócitos, está ativada. A dosagem plasmática de SOD1 em doadores saudáveis (28.3, 15.6 – 37.75 ng/mL,  n= 20), portadores assintomáticos (193.6, 170.2–327.4 ng/mL,  n =19), pacientes HAM/TSP (38,1, 10,6 – 59,25 ng/mL, n = 14) e pacientes ATLL (270.6, 141.8 – 456.9 ng/mL, n=25) demonstrou que a concentração de SOD1 é significativamente menor (p<0,0001) em pacientes HAM/TSP, em comparação aos portadores assintomáticos e pacientes ATLL, o que pode explicar o sucesso terapêutico de antioxidantes, como a vitamina C para esta forma clínica;  significativamente maior (p<0,0001) em portadores assintomáticos, em comparação aos pacientes HAM/TSP e doadores saudáveis, o que também poderia  sugerir SOD1 como um marcador de prognóstico para ATLL; que está significativamente  maior (p<0,0001) em pacientes ATLL, quando comparada a de pacientes HAM/TSP e a de doadores saudáveis, o que pode representar um alvo terapêutico promissor para o tratamento dessa patologia. Foi possível demonstrar também perda gradativa da viabilidade, dos linfócitos MT2 e MT4, com o aumento da concentração de DETC; e maior sensibilidade de MT4 (IC50=11.92µM), a esse fármaco quando comparado com MT2 (IC50= 26.45µM). Determinamos também, o ápice de resposta positiva ao tratamento com DETC em concentração superior em linfócitos MT2 (50 µM) comparado aos linfócitos MT4 (10 µM). A utilização do antioxidante NAC  para a validação da inibição de SOD1 via DETC, mostrou-se mais proeminente em MT2, nos quais foi possível reverter a ação do DETC até 500μM, mantendo metade da viabilidade celular até 2000μΜ, do que em linfócitos MT4, nos quais reverte a ação oxidante do DETC até 10μM. Tais resultados são corroborados pelo fato de os linfócitos MT2 possuírem uma concentração basal de SOD1 (6.73, 4.47–10.43 ng/mL) superior à de linfócitos MT4 (3.15, 2.78–3.5 ng/mL). CONCLUSÃO: SOD1 poderia ser sugerida como um potencial alvo terapêutico para ATLL, assim como a utilização do DETC como uma terapia pro-oxidante promissora nesta patologia.                                                                     


  • Mostrar Abstract
  • INTRODUCTION: Secondary treatments mechanism, such as the use of antioxidants and interferon (IFN) type 1, for the pathology associated with Human T-cell lymphotropic Virus type 1 (HTLV-1), HTLV-1 Associated Myelopathy/Tropical Spastic Paraparesis (HAM/TSP), is not elucidated, but, it is based on protection against Reactive Oxygen Species (ROS). The human Superoxide Dismutase 1 (SOD1) enzyme catalyzes the dismutation of superoxide radicals and it is important for the HTLV-1 survival in the intracellular environment. Inhibitory mechanisms of this enzyme, using diethyldithiocarbamate (DETC) for example, could increase the intracellular superoxide concentration, triggering oxidative stress and inducing cell death trough apoptosis. Thus, the regulation of superoxide in infected lymphocytes through the SOD1 antioxidant activity could be a therapeutic target for Adult T-cell leukemia/lymphoma (ATLL), another pathology also associated with HTLV-1. OBJECTIVE: To investigating the antioxidant SOD1 enzyme as a potential therapeutic target for ATLL; and its inhibitor, DETC, as a promising pro-oxidant therapy for this pathology. MATERIAL AND METHODS: The Gene Expression Omnibus (GEO) database was used to the search for gene expression datasets associated with ATLL clinical forms (Indolent, chronic, lymphomatous, and acute). The meta-analysis of these data was performed using the Ingenuity Pathway Analysis (IPA) software. SOD1 plasmatic concentrations in symptomatic infected individuals (ATLL and HAM/TSP), asymptomatic carriers, and uninfected healthy subjects were evaluated by enzyme-linked immunosorbent assay ELISA Cu/Zn-SOD. MT2 and MT4 T lymphocytes were used in the in vitro assays to evaluate the basal cytoplasmatic concentration of SOD1 by Cu/Zn-SOD ELISA; and also, for evaluation of SOD1 inhibition using DETC. The DETC apoptotic capacity and the validation of its action using the antioxidant N-acetylcysteine (NAC) were evaluated by flow cytometry and quantified by staining the cells with Hoechst 33432. RESULTS AND DISCUSSION: In the chronic and acute clinical forms of ATLL, we have observed that the NFE2L2 gene, related to the antioxidant response regulation, is being differentially expressed, under positive regulation, and that the classical lymphocyte proliferation pathway is activated.
    SOD1 plasmatic quantifications in healthy donors (28.3, 15.6-37.75 ng/mL, n = 20), asymptomatic carriers (193.6, 170.2-327.4 ng/mL, n = 19), HAM/TSP patients (38.1, 10.6-59.25 ng/mL, n = 14) and ATLL patients (270.6, 141.8-456.9 ng/mL, n = 25) demonstrated that SOD1 concentration is significantly lower (p <0.0001) in HAM/TSP individuals, compared to asymptomatic carriers and ATLL patients, which may explain the therapeutic success of antioxidants, such as vitamin C, used in this clinical form; SOD1 concentration is also significantly higher (p <0.0001) in asymptomatic carriers compared to HAM/TSP and healthy donors, which could suggest SOD1 as a prognostic marker for ATLL; and significantly higher (p <0.0001) in ATLL patients, when compared to HAM/TSP and healthy donor patients, which may represent a promising therapeutic target for the treatment of this pathology. It was also possible to demonstrate a gradual decrease of cell viability, of MT2 and MT4 lymphocytes, with the increase of DETC concentration, and a greater sensitivity, to this drug, of MT4 cells (IC50 = 11.92μM) when compared to MT2 cells (IC50 = 26.45μM). We also determined the maximum of positive response to DETC treatment that was superior in MT2 lymphocytes (50μM) compared to MT4 lymphocytes (10μM). The reversion of DETC action in the two type of cells using the antioxidant NAC, for validation of SOD1 inhibition by DETC, was more prominent in MT2 (Up to 500μM DETC) than in MT4 lymphocytes (Up to 10μM DETC). These results are corroborated by the fact that MT2 lymphocytes have higher SOD1 basal cytoplasmatic concentration (6.73, 4.47–10.43 ng/mL) than MT4 lymphocytes (3.15, 2.78–3.5 ng/mL). CONCLUSION: SOD1 could be suggested as a potential therapeutic target for ATLL, as well as the use of DETC as a promising pro-oxidant therapy in this pathology.

2
  • LUCAS MATHEUS GONÇALVES DE OLIVEIRA
  • Bifidobactérias e lactobacilos da microbiota intestinal e sua relação com marcadores clínicos e imunológicos na Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica

  • Orientador : GYSELLE CHRYSTINA BACCAN
  • MEMBROS DA BANCA :
  • GYSELLE CHRYSTINA BACCAN
  • NESTOR ADRIAN GUERRERO GUTIERREZ
  • ANA MARIA CAETANO DE FARIA
  • Data: 03/07/2019

  • Mostrar Resumo
  • Uma série de estudos contribuem para a ideia de que a microbiota intestinal (MI) possui papel na regulação metabólica e imunológica do hospedeiro. Existem evidências de que a MI está envolvida no controle da secreção de hormônios como a insulina através da liberação de GLP-1 e controle da saciedade pela modulação do PYY. Além disso, a MI se mostra importante para o desenvolvimento da placa de Peyer e do sistema imune como um todo, especialmente nos primeiros anos de vida. Dentre a diversidade da MI é possível ressaltar as bactérias dos gêneros Lactobacillus e Bifidobacterium, as quais parecem exercer funções imunorregulatórias e são largamente utilizadas como probióticos. A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) é uma enfermidade causada geralmente pela inalação de partículas e gases nocivos que causam danos prolongados às vias aéreas e/ou alvéolos, prejudicando assim o seu papel fisiológico e causando sintomas como dispneia, tosse crônica e expectoração. A inalação de gases tóxicos leva a um processo inflamatório caracterizado pelo aumento sistêmico de moléculas como proteínas de fase aguda, além de IL-1, IL-6, IL-8, TNF e seus receptores. Alguns estudos demonstram que a utilização de probióticos a base de Lactobacillus sp. e Bifidobacterium sp. Pode auxiliar no quadro geral da doença. Entretanto, a relação entre os níveis dessas bactérias na MI e a DPOC não se encontra bem elucidada. Portanto, este trabalho tem como objetivo avaliar se ocorrem alterações nos níveis de Lactobacillus sp. e Bifidobacterium sp. em pacientes com DPOC e relacionar os níveis dessas bactérias com marcadores clínicos e inflamatórios.


  • Mostrar Abstract
  • A number of studies contribute to the idea that the intestinal microbiota (IM) plays a role in the metabolic and immune regulation of the host. There is evidence that IM is involved in the control of secretion of hormones such as insulin through the release of GLP-1 and control of satiety by the modulation of PYY. In addition, MI is important for the development of Peyer's plaque and the immune system as a whole, especially in the early years of life. Among the diversity of MI, it is possible to highlight bacteria of the genus Lactobacillus and Bifidobacterium, which appear to exert immunoregulatory functions and are widely used as probiotics. Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) is a disease usually caused by inhalation of harmful particles and gases that cause prolonged damage to the airways and / or alveoli, thus impairing their physiological role and causing symptoms such as dyspnea, chronic cough and expectoration. Inhalation of toxic gases leads to an inflammatory process characterized by the systemic increase of molecules as acute phase proteins, in addition to IL-1, IL-6, IL-8, TNF and its receptors. Some studies have shown that the use of probiotics based on Lactobacillus sp. and Bifidobacterium sp. It can help in the general picture of the disease. However, the relationship between the levels of these bacteria in IM and COPD is not well elucidated. Therefore, this work aims to evaluate if there are changes in the levels of Lactobacillus sp. and Bifidobacterium sp. in patients with COPD and to correlate the levels of these bacteria with clinical and inflammatory markers.

3
  • JEFFERSON SODRÉ MENESES
  • Perfil metabolômico, propriedades biológicas e atividade tóxica de Abarema cochliacarpos, Alpinia speciosa, Euphorbia tirucalli, Miconia albicans e Protium heptaphyllum

  • Orientador : LUZIMAR GONZAGA FERNANDEZ
  • MEMBROS DA BANCA :
  • LUZIMAR GONZAGA FERNANDEZ
  • LOURDES CARDOSO DE SOUZA NETA
  • NINA CLÁUDIA BARBOZA DA SILVA
  • Data: 04/07/2019

  • Mostrar Resumo
  • As plantas medicinais sempre foram usadas para o tratamento de doenças. De modo a avaliar o perfil metabólico e as propriedades antioxidante, antimicrobiana e tóxica de plantas usadas por comunidades tradicionais da região Nordeste do Brasil, cinco plantas medicinais (Abarema cochliacarpos, Euphorbia tirucalli L., Alpinia zerumbet, Miconia albicans e Protium heptaphyllum) foram selecionadas com base na revisão de literatura e no uso dessas plantas por essas comunidades, bem como suas indicações terapêuticas. Folhas, caules e casca das plantas foram coletados na Reserva de Sapiranga, Mata de São João, no Litoral Norte da Bahia, secas a temperatura ambiente e moídas até a obtenção de pó fino. Os extratos brutos foram obtidos por maceração em etanol. A atividade antioxidante foi determinada pelo ensaio de eliminação do radical 2,2-difenil-1-picril-hidrazila. Os fenólicos totais foram quantificados pelo método de Folin-Ciocalteau. A atividade antimicrobiana foi avaliada como concentração inibitória mínima (CIM) usando o ensaio de microdiluição, em placas de 96 poços contra bactérias Gram-positivas - Bacillus subtilis (Bs), Staphylococcus aureus (Sa), Streptococcus mutans (Sm)e Micrococcus luteus (Ml), e Gram-negativas - Escherichia coli (Ec), Pseudomonas aeruginosa (Pa) e Salmonella typhimurium (St). A atividade tóxica foi realizada contra náuplios II de Artemia salina. O perfil metabolômico foi realizado utilizando LC-MS. Quanto a atividade antioxidante, o IC50 para A. zerumbet foi de 15.87μg.mL-1 enquanto para extratos de P. heptaphyllum variou de 4,67 μg.mL-1 (casca) a 22,16 μg.mL-1 (folhas). Para A. cochliacarpos os valores variaram de 3,81 μg.mL-1 (caule) a 5,58 μg.mL-1 (folhas). Para M. albicans variou de 4,63 μg.mL-1 (folhas) a 5,05 μg.mL-1 (caule). E. tirucalli apresentou a menor atividade antioxidante, já que o valor de IC50 foi 317,2 μg.mL-1. Os maiores valores de fenólicos totais foram evidenciados nos extratos de A. cochliacarpos, variando de 70,11 mgEGA.g-1 (folhas) a 100,22 mgEGA.g-1 (casca). O menor valor foi do extrato de E. tirucalli (9,65 mgEGA.g-1). Para A. zerumbet o valor encontrado foi 22,46 mgEGA.g-1 e para P. heptaphyllum os valores variaram de 24,66 mgEGA.g-1 (folha) a 58,22 mgEGA.g-1 (casca). O conteúdo fenólico total dos extratos de Miconia albicans variou de 49,70 a 52,71 mgEGA.g-1para os extratos de folha e casca, respectivamente. O extrato de M. albicans (caule) mostrou atividade antimicrobiana contra Pa, Sa, Bs e Bc. O extrato de A. zerumbet inibiu o crescimento bacteriano na concentraçãode 500 μg.mL-1para Bc e Ec, de 125 μg.mL-1 para Sa. A atividade antibacteriana dos extratos de P. heptaphyllum foi elevada com CIM de 15,62 μg.mL-1 para Ml. O extrato de M. albicans demonstrou uma atividade antimicrobiana conspícua contra as bactérias gram-positivas. Houve também atividade contra a bactéria gram-negativa Pa. Todas as espécies exibiram taxa de letalidade de 100% de Artemia salina na concentração de 1000 μg.mL-1 de extrato. A análise metabolômica dos extratos por HPLC-MS permitiu quantificar diversos metabólitos secundários, tais como flavonoides, compostos fenólicos, fenilpropanóides, terpenos e alcaloides, dentre outros. Conclui-se que estas espécies apresentam grande potencial farmacológico considerando a elevada atividade antioxidante, perfil antimicrobiano e toxicológico correlacionados aos compostos bioativos identificados através do perfil metabolômico.


  • Mostrar Abstract
  • Medicinal plants have always been used for the treatment of diseases. In order to evaluate the metabolic profile and antioxidant, antimicrobial and cytotoxic properties of plants used by traditional communities in the Northeast region of Brazil, five medicinal plants (Abarema cochliacarpos, Euphorbia tirucalli, Alpinia zerumbet, Miconia albicans and Protium heptaphyllum) were selected based in the literature review and the use of these plants by these communities, as well as their therapeutic indications. Leaves, stems and bark of the plants were collected at the Sapiranga Reserve, Mata de São João - BA, dried at room temperature and ground. The extracts were obtained by maceration in ethanol. The antioxidant activity was determined by the elimination test of the 2,2-diphenyl-1-picryl-hydrazyl radical. Total phenolics were quantified by the Folin-Ciocalteau method. The antimicrobial activity was evaluated as minimum inhibitory concentration (MIC) using the microdilution assay in 96-well plates against Gram-positive Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Streptococcus mutans and Micrococcus luteus and Gram-negative Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa and Salmonella typhimurium. Cytotoxic activity was performed against nauplius II of Artemia salina. The metabolomic profile was performed using LC / MS. As for the antioxidant activity, the IC50 for A. zerumbet was 15.87 μg.mL-1 whereas for extracts of P. heptaphyllum it varied from 4.67 μg.mL-1 (bark) to 22.16 μg.mL-1 (leaves). For A. cochliacarpos the values ranged from 3.81 μg.mL-1 (stem) to 5.58 μg.mL-1(leaves). For M. albicans it varied from 4.63 μg.mL-1 (leaves) at 5.05 μg.mL-1 (stem). E. tirucalli presented the lowest value of 317.2 μg. mL-1. The highest values of total phenolics were evidenced in the extracts of A. cochliacarpos, ranging from 70.11 mgEGA.g-1 (leaves) to 100.22. mgEGA.g-1 (bark). The lowest value was obtained from E. tirucalli extract (9.65 μg.mL-1). For A. zerumbet the found value was 22.46 mgEGA.g-1. For P. heptaphyllum the values ranged from 24.66 mgEGA.g-1 (leaf) to 58.22 mgEGA.g-1 (bark). The total phenolic content of the extracts of Miconia albicans ranged from 49.70 to 52.71 mgEGA.g-1. The extract of M. albicans (stem) showed antimicrobial activity against Pa, Sa, Bs and Bc. Alpinia extract inhibited bacterial growth at concentrations of 500 μg. mL-1 for Bc, 125 μg. mL-1 for Sa and 500 μg. mL-1 for Ec. The antibacterial activity of the extracts of P. heptaphyllum was high with MIC of 15.62 μg.mL for Ml. The M. albicans extract demonstrated conspicuous antimicrobial activity against gram-positive bacteria. There was also activity against gram-negative Pa bacteria. All species exhibited lethality rate of 100% Artemia salina at the concentration of 100 μg. mL-1 extract. The metabolic analysis of extracts by HPLC/MS allowed the quantification of several secondary metabolites, such as flavonoids, phenol compounds, phenylpropanoids, terpenes and alkaloids, among others.

Teses
1
  • LUÃ TAINÃ COSTA REIS
  • EFEITOS INTERGERACIONAIS E DE LONGO PRAZO DE HERBICIDA À BASE DE GLIFOSATO NO SISTEMA NERVOSO CENTRAL

  • Orientador : SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA
  • JOSE ANTONIO MENEZES FILHO
  • MARIMÉLIA APARECIDA PORCIONATTO
  • TÂNIA ARAÚJO VIEL
  • RAPHAEL FERREIRA QUEIROZ
  • Data: 26/04/2019

  • Mostrar Resumo
  • O glifosato um dos herbicidas mais vendidos no mundo sob diferentes formulações

    comerciais conhecidas como herbicidas à base de glifosato (GBH). Os agroquímicos se

    tornaram um problema de saúde pública devido ao aumento da exposição, diferenças na

    toxicologia de acordo com formulações variadas e capacidade de agir como

    desreguladores endócrinos alterando a sinalização hormonal. Dentro dos órgãos e eixos

    biológicos afetados por desreguladores endócrinos, o eixo hipotálamo-hipófise-tireoide

    (HPT), devido ao controle e liberação de hormônios da tireoide (HT) responsável por

    vários efeitos biológicos e células neuronais e gliais devido a susceptibilidade a alterações

    durante neurodesenvolvimento, são relevantes para pesquisar os efeitos da exposição a

    herbicidas. No primeiro capítulo, o objetivo do estudo foi avaliar a ação da desregulação

    endócrina de herbicidas à base de glifosato (GBH) na homeostase do hormônio

    tireoidiano no cerebelo. Ratas Wistar gestantes expostas solução Roundup Transorb

    (Monsanto) foram divididas em 2 grupos de tratamento (5 mg / kg / dia e 50 mg / kg /

    dia) e controle, expostos a partir do 18° dia (GD18) até o 5° dia pós-natal (PND5). Os

    filhotes machos foram sacrificados em PND 90 e a análise por qPCR dos genes

    relacionados ao metabolismo e função dos hormônios tireoidianos foi avaliada no tecido

    cerebelar. Como resultado, no tecido do cerebelo de filhotes machos expostos houve

    desregulação de todos os genes diretamente relacionados ao metabolismo intracelular do

    hormônio tireoidiano, Trα1, Trβ1 e Trβ2, Mct8, Oatp1c1, Dio2, Dio3. Além disso, tem

    sido demonstrado que animais tratados apresentaram alterações intergeracionais em

    reguladores chave das mudanças epigenéticas Dnmt3A, indicando um possível

    mecanismo epigenético por trás da ação disruptor. Culturas cerebelares primárias obtidas

    de ratos Wistar expostos a doses de 1 a 100 partes por milhão (ppm) durante um período

    de 24 horas induziram ativação mitocondrial e diminuição de astrócitos positivos para

    GFAP, embora nenhuma toxicidade tenha sido observada nesta dose.

    O segundo capítulo teve como objetivo avaliar os efeitos a longo prazo de doses subtóxicas

    de glifosato puro e GBH Roundup Transorb no neurodesenvolvimento. Utilizando células

    neuroepiteliais diretamente expostas (células parentais) à dose sub-tóxica de 2,5 ppm de

    (GBH), e observando os efeitos nas células que não foram diretamente expostas (F1) ao

    glifosato ou GBH, observamos que o GBH induziu uma maior toxicidade e desregulação

    no neurodesenvolvimento em comparação com o glifosato puro. Exposição ao GBH

    ativou os processos autofágicos, além de induzir a desregulação dos principais genes do

    neurodesenvolvimento, como HES1, HES5, DDK1 e TRKB, juntamente com os

    marcadores neuronais NESTIN, DCX, PAX6, GFAP, TUJ1 e MAP2. As células F1

    tratadas com GBH também mostraram alterações a longo prazo na morfologia, com

    aumento do número de células por agregados e alterações na proporção de células

    neuronais.

    Em resumo, o GBH foi capaz de induzir mudanças a longo prazo nos reguladores da

    homeostase e do neurodesenvolvimento dos hormônios tireoidianos, mesmo em doses

    que não apresentaram toxicidade.


  • Mostrar Abstract
  • Glyphosate is one of the best-selling herbicides in the world under different commercial

    formulations known as glyphosate-based herbicides (GBH). Agrochemicals have become

    a public health problem due to increasing exposure, differences in toxicology according

    to varied formulations and ability to act as endocrine disrupters altering hormone

    signaling. Within the organs and biological axes affected by endocrine disrupters, the

    hypothalamic-pituitary-thyroid axis (HPT) due the control and release of thyroid

    hormones (HT) responsible for various biological effects and neurons/glial cells due

    being susceptible to changes during the early stages of neurodevelopment, are relevant to

    research the effects of herbicide exposure. In the first chapter the objective of the study

    was to evaluate the endocrine disruption action of herbicides based on glyphosate (GBH)

    on thyroid hormone homeostasis in the cerebellum. Pregnant Wistar rats exposed to

    Roundup Transorb solution (Monsanto) were divided into 2 treatment groups (5 mg / kg

    / day and 50 mg / kg / day) and control, exposed from the 18th day of gestation (GD18)

    to postnatal day 5 (PND5). Male offspring were sacrificed in PND 90 and qPCR analysis

    of genes related to the metabolism and function of thyroid hormones evaluated in

    cerebellar tissue. As a result, in the cerebellum tissue of exposed male pups there was

    deregulation of all genes directly related to the intracellular metabolism of thyroid

    hormone, TRα1, TRβ1 e TRβ2, Mct8, Oatp1c1, Dio2, Dio3. In addition, it has been shown

    that treated animals presented intergenerational changes in the key regulator of epigenetic

    marks Dnmt3A, indicating a possible epigenetic mechanism behind the disruptor action.

    In addition, primary cerebellar cultures obtained from 8-day Wistar rats exposed to doses

    ranging from 1 to 100 parts per million (ppm) over a 24-hour period induced

    mitochondrial activation and decrease of GFAP positive astrocytes, although no toxicity

    was observed at this dose.

    The second chapter aimed to evaluate the long-term effects of suboxic doses of pure

    glyphosate and GBH Roundup Transorb on neurodevelopment. Using directly exposed

    neuroepithelial cells (parental cells) at the sub-toxic dose of 2.5 ppm of both glyphosate

    and glyphosate-based herbicide formulations (GBH), and observing the effects on cells

    that were not directly exposed (F1) to glyphosate or (GBH), we found that GBH induced

    more toxic and developmental dysregulation compared to pure glyphosate. GBH

    exposure activated autophagic processes, in addition to inducing dysregulation of key

    neurodevelopment genes such as HES1, HES5, DDK1 and TRKB together with the

    neuronal markers NESTIN, DCX, PAX6, GFAP, TUJ1 and MAP2. GBH treated F1 cells

    also showed long-term changes in morphology with increased number of cells per clusters

    and changes in the proportion of neuronal cells.

    In summary, GBH was able to induce long-term changes in regulators of thyroid hormone

    homeostasis and neurodevelopment, even at doses that did not show toxicity.

2018
Dissertações
1
  • ALBERTO LEONCIO BARRETO VASCONCELOS
  • HIVfird: Software de detecção de mutações associadas à resistência terapêutica dos Inibidores de Fusão em sequências do HIV-1

  • Orientador : JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EDUARDO GALEMBECK
  • JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • LUCIANE AMORIM SANTOS
  • Data: 12/12/2018

  • Mostrar Resumo
  • O HIV foi descoberto em 1983 e já matou de mais de 35 milhões de pessoas em todo o mundo enquanto atualmente 36,9 milhões são portadoras deste vírus. O HIV-1 é a variante mais distribuída no mundo e sua alta taxa de mutação é uma de suas características mais marcantes, resultando no aparecimento de cepas com resistência aos medicamentos antirretrovirais disponíveis, o que torna vital o desenvolvimento de novos medicamentos. Inibidores de fusão são antirretrovirais de terceira linha que impedem a entrada do vírus nas células do hospedeiro e atualmente o Enfuvirtida é o único antirretroviral dessa classe disponível no mercado. Embora existam softwares que determinem a resistência de cepas de HIV-1 à grande maioria dos medicamentos, ainda não existe nenhuma ferramenta específica para os inibidores de fusão. O objetivo deste trabalho foi o desenvolvimento de uma ferramenta de acesso livre para a identificação de mutações associadas com resistência a medicamentos antirretrovirais inibidores de fusão em sequências genômicas do HIV-1. Secundariamente, este trabalho avaliou a prevalência de resistência ao Enfuvirtida nas populações brasileira e mundial e comparou o grau de resistência entre os diferentes genótipos virais. O HIVfird foi desenvolvido utilizando a linguagem de programação PHP e utiliza o programa Kalign para realizar alinhamentos de sequências de DNA. Como referência para realizar o alinhamento com as sequências inseridas pelo usuário, a ferramenta utiliza 30 bases de DNA obtidas a partir da proteína gp41 (aminoácidos 36 a 45) do HIV-1 HXB2. Para avaliar o grau de resistência ao Enfuvirtida nas populações estudadas, todas as sequências de HIV-1 que possuíam a região genômica associada com resistência ao Enfuvirtida foram extraídas do banco de dados dos Los Alamos National Laboratory. O software HIVfird encontra-se hospedado no endereço https://www.hivfird.ics.ufba.br/, totalmente funcional e disponível para uso público. Foram identificadas na literatura 25 substituições de aminoácidos que isoladamente causam algum grau de resistência ao medicamento e 15 combinações de 2 substituições distintas associadas com a diminuição da susceptibilidade ao Enfuvirtida no fragmento compreendido entre os aminoácidos 36 a 45 da sequência proteica da gp41. As posições 44, 43, 36 e 38 foram as que apresentaram a maior frequência de variações associadas com resistência ao medicamento. A partir dessa nova ferramenta, caracterizamos as sequências de DNA presentes no banco de dados de Los Alamos, onde foram encontradas tais substituições em 3,16% nas sequências da população mundial e 4,67% em sequências da população brasileira. A prevalência de resistência ao Enfuvirtida foi identificada para os diferentes subtipos do HIV e verificou-se que a taxa foi significativamente maior para o subtipo B em comparação com o subtipo C (p < 0,0001), o que pode estar relacionado com características econômicas e geográficas. Por fim, espera-se que o uso do HIVfird seja acrescentado no rol de ferramentas de análise de resistência aos antirretrovirais e auxilie profissionais de saúde no planejamento e acompanhamento clínico, bem como a sua utilização para estudos populacionais de resistência ao medicamento pela comunidade científica.


  • Mostrar Abstract
  • The HIV was discovered in 1983 and has killed more than 35 million people worldwide while currently 36.9 million are carriers of this virus. HIV-1 is the most widely distributed strain in the world and its high mutation rate is one of the most striking features, resulting in the emergence of strains with resistance to available antiretroviral drugs, which makes the development of new drugs vital. Fusion inhibitors are third-line antiretrovirals that prevent viral entry into host cells and Enfuvirtide is currently the only marketed antiretroviral of this class. Although there are tools that determines the resistance of HIV-1 strains to most drugs, there are still no specific software for fusion inhibitors. The aim of this work was the development of a free access tool to identify mutations associated with resistance of HIV-1 virus genotypes to antiretroviral fusion inhibitor drugs. Secondarily, this work evaluated the prevalence of Enfuvirtide resistance in Brazilian and world populations and compared the level of resistance between different viral genotypes. The HIVfird was developed using the PHP programming language and uses Kalign to perform DNA sequences alignments. As a reference for alignment with user-inserted sequences, the tool utilizes 30 DNA bases obtained from the HIV-1 HXB2 gp41protein (amino acids 36 to 45). To assess the level of resistance to Enfuvirtide in the populations studied, all HIV-1 sequences that possessed the genomic region associated with Enfuvirtide resistance were retrieved from the Los Alamos National Laboratory database. The HIVfird software is hosted at https://www.hivfird.ics.ufba.br/, fully functional and available for public use. Twenty-five amino acid substitutions that alone have caused some level of drug resistance and 15 combinations of 2 distinct substitutions associated with decreased susceptibility to Enfuvirtide have been identified in the fragment between amino acids 36 to 45 of the gp41 protein sequence. Positions 44, 43, 36 and 38 were the ones with the highest frequencies of variations associated with drug resistance. From this new tool, we characterize DNA sequences present in the Los Alamos database, where such substitutions were found in 3.16% in the world population sequences and 4.67% in Brazilian population sequences. The prevalence of resistance to Enfuvirtide was identified for the different subtypes of HIV and was found that the rate was significantly higher for subtype B compared to subtype C (p < 0,0001) and may be due to economical and geographical factors. Finally, it is expected that HIVfird will be added to a list of antiretrovirals analysis tools and assist health professionals in planning and monitoring Enfuvirtide use as well as population-based analyzes of drug resistance by the scientific community.

2
  • DIEGO DE CARVALHO CARNEIRO
  • Isolamento, Caracterização e Potencial Biotecnológico de Lectinas de Microalgas

  • Orientador : SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • EDERLAN DE SOUZA FERREIRA
  • MICHELE DALVINA CORREIA DA SILVA
  • SUZANA TELLES DA CUNHA LIMA
  • Data: 17/12/2018

  • Mostrar Resumo
  • Para avaliar em escala laboratorial o potencial biotecnológico de sete espécies de microalgas clorofíceas, foram realizadas análises de suas taxas de crescimento específico em diferentes condições de cultura, produtividade de biomassa e conteúdos de proteína e lectina. Lectinas da microalga Scenedesmus obliquus foram isoladas por cromatografia de afinidade utilizando uma coluna de goma guar produzida a partir da reticulação desse polissacarídeo com glutaraldeído. Essas lectinas foram parcialmente caracterizadas por meio de géis SDS-PAGE e por um ensaio de inibição da atividade de hemaglutinação. Como resultados, temos que a aeração do meio de cultura pode significativamente melhorar a cinética de crescimento de todas as espécies estudadas. Ankistrodesmus fusiformis e S. obliquus apresentaram os maiores valores de conteúdo de proteína (22 e 25%, respectivamente), sendo os mais apropriados para a produção de produtos proteicos. Desmodesmus brasiliensis demonstrou a maior taxa de produtividade de biomassa (0,14 g L-1 dia-1 ), o que compensa seu menor valor de conteúdo de proteína. No entanto, o baixo conteúdo de proteína de Chlamydocapsa bacillus (11%) e as baixas cinéticas de crescimento de Coelastrum microporum e Kirchneriella lunaris podem dificultar a aplicação dessas espécies na produção de proteínas em grandes quantidades. Valores específicos de coeficientes de extinção percentual podem ser utilizados como alternativa a outros métodos para a quantificação de proteínas de microalga. Medições dos títulos de hemaglutinação e atividades de hemaglutinação específicas dos extratos brutos de proteína indicaram que Pseudokirchneriella subcapitata e K. lunaris possuem os maiores conteúdos de lectina. As lectinas isoladas de S. obliquus apresentaram afinidade de ligação a galactose como demonstrado pelo teste de inibição da atividade de hemaglutinação e bandas de 46 e 148 kDa de peso molecular aparente no gel de eletroforese em poliacrilamida. Um pequeno aumento dos pesos moleculares aparentes das lectinas eluídas com galactose indicou uma possível mudança conformacional na proteína devido à ligação a galactose. Análises subsequentes serão necessárias para determinar se as bandas de proteína observadas são lectinas monoméricas distintas ou monômeros de uma única lectina ligados por interações intermoleculares fracas ao invés de ligações covalentes como as pontes dissulfeto.


  • Mostrar Abstract
  • To assess in laboratory scale the biotechnological potential of seven species of Chlorophyceae microalgae, it was performed analyses of their specific growth rate under different culture conditions as well as measurements of their biomass productivity and protein and lectin contents. Lectins from the microalga Scenedesmus obliquus were isolated by affinity chromatography using a column of guar gum cross-linked with glutaraldehyde. Those lectins were partially characterized by SDS-PAGE gels and an inhibition of hemagglutinating activity assay. As a result, aeration of the microalgae cultures was able to significantly enhance growth for all strains studied. Ankistrodesmus fusiformis and S. obliquus presented the higher values of protein content (22 and 25%, respectively), so they are the most suitable species for production of proteic products. Desmodesmus brasiliensis showed the higher biomass productivity (0.14 g L-1 day-1 ), which compensates its lower value of protein content. However, the low protein content of Chlamydocapsa bacillus (11%) and the low growth rate of Coelastrum microporum and Kirchneriella lunaris can hinder their suitability for high yield production of proteins. Specific values of percent extinction coefficients can be used as an alternative to other protein quantification methods. Hemagglutinating titers and specific hemagglutinating activities from the crude protein extracts indicated that Pseudokirchneriella subcapitata and K. lunaris have the higher lectin contents. The lectins isolated from Scenedesmus obliquus presented binding affinity to galactose as demonstrated by the inhibition of hemagglutinating activity assay and bands of 46 and 148 kDa of apparent molecular weights in polyacrylamide electrophoresis gels. A slight increase of the molecular weights of the lectins eluted with galactose indicated that a possible conformational change occurred due galactose binding. Subsequent analyses will be necessary to ascertain if the protein bands observed are distinct monomeric lectins or monomers from a single lectin bound through weak intermolecular interactions rather than covalent bonds such as disulfide bridges.

3
  • RODRIGO CUNHA OLIVEIRA
  • RECONSTRUÇÃO FILODINÂMICA DO SUBTIPO C DO VÍRUS DA IMUNODEFICIÊNCIA HUMANA TIPO 1 NO BRASIL E SUA DISPERSÃO PARA A REGIÃO NORDESTE DO PAÍS.

  • Orientador : JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • MEMBROS DA BANCA :
  • JOANA PAIXAO MONTEIRO CUNHA
  • ANDREA THOMPSON DA POIAN
  • FILIPE FERREIRA DE ALMEIDA REGO
  • Data: 20/12/2018

  • Mostrar Resumo
  • INTRODUÇÃO: O Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) é o agente etiológico da Síndrome da Imunodeficiência Adquirida (AIDS), doença responsável pela morte de 39 milhões pessoas no mundo e ainda sem vacina e sem cura. O vírus apresenta dois tipos, 1 e 2;o tipo 1 é dividido em quatro grupos M, N, O e P e o grupo M é subdivido em 9 subtipos e formas recombinantes. O subtipo C é responsável por mais de 50% das infecções por HIV-1 em todo o mundo, tendo sido isolado primeiramente na Etiópia na década de 80 e encontrado em países populosos da África, Índia, China, Austrália, Europa e América do Sul. Na região sul do Brasil é a forma predominante do HIV-1, tendo sido relatado o aumento de sua circulação nas outras regiões do país. Estudos filogenéticos reconstruíram a história do subtipo C, evidenciando sua inserção no Brasil a partir de uma origem monofilética nessa região, relacionando às linhagens encontradas nos países da região centro-leste do continente africano. No Nordeste, o subtipo C tem sido detectado com uma prevalencia de 4-5% das infecções por HIV. OBJETIVO: Investigar a origem do subtipo C circulante na região Nordeste e avaliar o seu perfil migratório no território brasileiro. MATERIAIS E MÉTODOS: Sequências do gene pol, previamente classificadas como subtipo C, de 48 amostras do Brasil e 36 do mundo foram coletadas de bancos de dados públicos. As sequencias foram isoladas entre 1998 e 2015. Estas foram alinhadas utilizando o MAFFT e Bioedit. O subtipo das amostras foi confirmado através de análises filogenéticas, usando o método de Maximum Likelihood (ML), implementado no IqTree. A análise filodinâmica foi baseou-se no método Bayesiano através das ferramentas do software BEAST versão 1.8.4. RESULTADOS PRELIMINARES: A análise bayesiana indica a ocorrência de pelo menos cinco introduções do subtipo C no Brasil. Quarenta e quatro (91,7%) seqüências brasileiras do subtipo C formaram um clado monofilético composto exclusivamente de seqüências C do Brasil. Esse grupo teria se originado de países na África Oriental, como Burundi, Etiópia e Quênia, por volta de 1983 (1975 a 1992). As outras quatro introduções do subtipo C no Brasil datam de 1985-1990. Três delas foram representadas por seqüências do Sudeste do Brasil e teriam surgido da África do Sul, Tanzânia e Zâmbia. A quinta inserção do subtipo C no Brasil é representada por uma sequência de Roraima e teria se originado na Tanzânia, provavelmente em 1987. Múltiplas introduções da linhagem principal do subtipo C ocorreram entre 1986 e 2005 na região Nordeste e teriam se originado a partir das outras quatro regiões brasileiras. CONCLUSÕES: A epidemia de subtipo C no Brasil resulta de multiplas introduções dessa variante a partir de países do leste e do sul da África. A maioria dos vírus desse subtipo circulante no país deriva de uma única linhagem predominante. Pela primeira vez, uma introdução independente do subtipo C no norte do Brasil foi identificada. Um padrão de migração em curso do vírus para o norte do país é sustentado pelas análises. Os resultados mostram uma ampla difusão do subtipo C nas cinco regiões brasileiras e enfatiza o papel do estado de Goiás na disseminação do vírus para as regiões mais ao norte.


  • Mostrar Abstract
  • INTRODUCTION: The Human Immunodeficiency Virus (HIV) is the etiological agent of Acquired Immunodeficiency Syndrome (AIDS), a disease responsible for the deaths of 39 million people worldwide and still without a vaccine and without a cure. The virus has two types, 1 and 2, type 1 is divided into four groups M, N, O and P and group M is subdivided into 9 subtypes and recombinant forms. Subtype C accounts for more than 50% of HIV-1 infections worldwide, being first isolated in Ethiopia in the 1980s and found in populous countries of Africa, India, China, Australia, Europe and South America. In the southern region of Brazil, it is the predominant HIV-1 form and its circulation is also increasing in other regions of the country. Phylogenetic studies reconstructed the history of subtype C, evidencing its insertion in Brazil from a monophyletic origin in this region, relating to the lineages found in the countries of the central-east region of the African continent. In the Northeast, subtype C has been detected with a prevalence of 4-5% of HIV infections. OBJECTIVES: To investigate the origin of subtype C circulating in Northeast region and to evaluate its migratory profile in the Brazilian territory. MATERIALS AND METHODS: 48 pol gene sequences from Brazil and 36 from worldwide, isolated between 1998 and 2015, were collected from public databases. Sequences were aligned using MAFFT and Bioedit. Samples subtype was confirmed by phylogenetic analysis, using the Maximum Likelihood (ML) method, implemented in IqTree. The phylodynamic analysis was based on the Bayesian method using the BEAST software tools version 1.8.4. RESULTS: The Bayesian analysis indicates the occurrence of five introductions of subtype C in Brazil. Fourty four (91.7%) Brazilian subtype C sequences grouped into a monophyletic clade composed exclusively of C sequences from Brazil. This group would have originated from countries in East Africa like Burundi, Ethiopia and Kenia around 1983 (1975 to 1992). The other four subtype C introductions in Brasil date from 1985-1990. Three of them were are represented by sequences from Southeast of Brazil and would have emerged from South Africa, Tanzania and Zambia. The fifth subtype C insertion into Brazil is represented by a sequence from Roraima and would have originated from Tanzania, most likely in 1987. Multiple introductions of the subtype C main lineage occurred between 1986 and 2005 in Northeast region and would have originated from the other four Brazilian regions. CONCLUSIONS: The subtype C epidemic in Brazil results from multiple introductions of this variant from the countries of East and Southern Africa. Most of the viruses of this subtype circulating in the country, are derived from a single predominant lineage. For the first time, an independent introduction of subtype C in Northern Brazil was identified. An ongoing migration of the virus towards the North of the country is observed. The results show a wide diffusion of subtype C in the five Brazilian regions and emphasizes the role of Goias state in the dissemination of the virus to northern regions.

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